黃芩湯調(diào)控Nrf2通路對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制研究.pdf

1、黃芩湯是中醫(yī)經(jīng)典著作《傷寒論》中著名的方劑，由黃芩、芍藥、炙甘草和大棗配伍組成，具有清熱止痢、和中止痛的功效。臨床上常應(yīng)用于治療細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、急性胃腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎等胃腸道疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明黃芩湯具有明顯的抑菌、抗炎、解痙止痛和保肝等作用，但其藥效學(xué)及臨床研究還不夠深入，作用機(jī)制尚不明確。
　　本文從整體動(dòng)物和細(xì)胞兩個(gè)層面，采用潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型和RNAiCaco-2細(xì)胞模型，對(duì)黃芩湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的抗氧化應(yīng)激

2、作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為黃芩湯的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究目的:
　　1、建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，并觀察黃芩湯對(duì)其的治療作用，以明確黃芩湯的抗氧化應(yīng)激作用。
　　2、觀察黃芩湯對(duì)Caco-2細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激作用。
　　3、建立siRNANrf2干擾的Caco-2細(xì)胞模型，并觀察黃芩湯對(duì)siRNA Nrf2干擾的Caco-2細(xì)胞模型的影響，以探討黃芩湯通過(guò)調(diào)控Nrf2通路的抗氧化應(yīng)激作用

3、。
　　研究方法:
　　1、黃芩湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的氧化應(yīng)激的相關(guān)研究
　　健康雄性SD大鼠，運(yùn)用三硝基苯磺酸與乙醇混合的復(fù)合法制備細(xì)胞免疫反應(yīng)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型成功建立后，根據(jù)體重，將大鼠隨機(jī)分為黃芩湯高劑量組(20g/kg)、中劑量組(10g/kg)、低劑量組(5g/kg)、陽(yáng)性藥組(SASP，0.5 g/kg)、模型組，另設(shè)健康大鼠為止常組，每組7只。造模后第3天開始灌胃給藥，每天一次

4、，連續(xù)治療5天。觀察各組大鼠體重、飲食及狀態(tài)的變化，治療5d后所有大鼠眼眶取血、剖腹取結(jié)腸，采用HE染色法觀察大鼠結(jié)腸組織變化，采用生化法測(cè)定血清中GSH-px、CAT、SOD、MDA的含量，ELISA法測(cè)定血清中LPO的含量，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸組織中Nrf2蛋白的表達(dá)量，Western Blot法測(cè)定各組大鼠結(jié)腸組織中HO-1、NQO1蛋白的變化。
　　2、黃芩湯對(duì)Caco-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用的影響
　　取處于對(duì)數(shù)生

5、長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔約含2×105細(xì)胞。采用不同濃度的黃芩湯及SFN干預(yù)正常的Caco-2細(xì)胞36h，去除上清液，使用Trizol提取RNA，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HO-1、NQO1、GST、Keap1、Nrf2mRNA的表達(dá)，同理，按上述方法，使用蛋白裂解液提取蛋白，利用生化法檢測(cè)其SOD、MDA、GSH-px的表達(dá)，利用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)其ROS的相對(duì)表達(dá)，利用Western Blot法檢測(cè)其HO-

6、1、NQO1、GST、Keap1蛋白的表達(dá)。
　　3、黃芩湯對(duì)Nrf2基因干擾后Caco-2細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激作用的影響
　　3.1靶向Nrf2基因的siRNA Caco-2細(xì)胞的構(gòu)建和鑒定
　　按照Genebank中Nrf2的序列，根據(jù)Tuschl設(shè)計(jì)原則由吉瑪公司設(shè)計(jì)合成3對(duì)siRNA序列，1對(duì)通用陰性對(duì)照(Negative control，NC)序列，1對(duì)GAPDH陽(yáng)性對(duì)照。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔

7、約含2×105細(xì)胞，采用Lipo fectamine2000與siRNA融合，轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞，培養(yǎng)36h，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Caco-2細(xì)胞Nrf2 mRNA的表達(dá)，采用Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Caco-2細(xì)胞Nr2蛋白的表達(dá)。
　　3.2黃芩湯對(duì)siRNA Caco-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激的影響
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔約含2×105細(xì)胞。按照上述方法轉(zhuǎn)染各實(shí)驗(yàn)組6h

8、，采用不同濃度的黃芩湯及SFN干預(yù)轉(zhuǎn)染后的Caco-2細(xì)胞36h，去除上清液，使用Trizol提取RNA，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HO-1、NQO1、GST、Keap1、Nrf2 mRNA的表達(dá)，同理，按上述方法，使用蛋白裂解液提取蛋白，利用生化法檢測(cè)其SOD、MDA、GSH-px的表達(dá)，利用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)其ROS的相對(duì)表達(dá)，利用Western Blot法檢測(cè)其HO-1、NQO1、GST、Keap1蛋白的表達(dá)。
　　研

9、究結(jié)果:
　　1、黃芩湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療及抗氧化應(yīng)激作用
　　造模后，大鼠出現(xiàn)便血、便稀、懶動(dòng)、毛發(fā)晦暗無(wú)光澤、體重以及飲食下降等癥狀，結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯潰瘍，揭示造模成功。同時(shí)，HE結(jié)果顯示，其結(jié)腸組織出現(xiàn)不同程度的變化。與正常組相比，模型組血清中SOD、CAT、GSH-px的含量減少且有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），MPO、LPO的含量增加有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)腸組織Nrf2、H

10、O-1、NQO1蛋白的表達(dá)稍有增加。經(jīng)SASP和黃芩湯干預(yù)后，各給藥組大鼠的精神狀況有不同程度的改善。黃芩湯各劑量組大鼠的飲食量和體重有所增加，血清中SOD、CAT、GSH-px的含量較模型組均有不同程度的增加，血清中MPO、LPO的含量較模型組有所減少，結(jié)腸組織Nrf2、HO-1及NQO1蛋白的表達(dá)量較模型組也均有增加。
　　2、黃芩湯對(duì)Caco-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用的影響
　　與正常組相比，SFN組與HQT400μg/m

11、l可降低Caco-2細(xì)胞內(nèi)的ROS、MDA含量，且有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）;SFN組與HQT各劑量組均能增加細(xì)胞內(nèi)SOD含量，且SFN組與HQT400μg/ml有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01); SFN組與HQT高、中、低劑量組均能增加細(xì)胞內(nèi)GSH-px的含量，且具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0，01），且給藥后，各組的GST、HO-1、NQO1、Keap1、Nrf2 mRNA和其蛋白的含量均有增加，說(shuō)明

12、黃芩湯具有抗氧化應(yīng)激的作用。
　　3、黃芩湯對(duì)Nrf2基因干擾后Caco-2細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激作用的影響
　　3.1.靶向Nrf2基因的siRNA Caco-2細(xì)胞的構(gòu)建和鑒定
　　轉(zhuǎn)染靶向Nrf2的siRNA后，與空白對(duì)照組比較，3個(gè)siRNA片段對(duì)Nrf2均有明顯的抑制作用，RT-PCR的結(jié)果顯示其抑制率分別60.55％，70.83％，45.33％，其中Nrf2-821 siRN片段抑制率最高，故將其可作為目標(biāo)靶序

13、列。并且其Western Blot結(jié)果顯示，上述處理對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)有一定的干擾。說(shuō)明靶向Nrf2基因的siRNA Caco-2細(xì)胞的構(gòu)建成功，為下一步黃芩湯對(duì)其的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　3.2.黃芩湯對(duì)siRNA Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA后，與正常組相比，模型組的ROS、MDA增加，SOD、GSH-px及GST、HO-1、NQO1、Keap1mRNA及蛋白均有不同程度的減少，給藥

14、后，與模型組相比，各給藥組SOD、GSH-px的含量有不同程度的增加，SFN組與HQT400μg/ml的ROS、MDA含量均有不同程度的降低;Western Blot結(jié)果顯示，GST、HO-1、NQO1、Keap1、Nrf2的蛋白表達(dá)均有不同程度增加;RT-PCR結(jié)果顯示，GST、HO-1、NQO1、Keap1、Nrf2 mRNA的表達(dá)均有不同程度增加，揭示Nrf2通路在氧化應(yīng)激中起著重要作用，黃芩湯通過(guò)Nrf2通路對(duì)其氧化應(yīng)激進(jìn)行調(diào)節(jié)