α-亞麻酸和花生四烯酸對HepG2細(xì)胞CYP7A1表達(dá)的影響及Nrf2的調(diào)控.pdf

1、非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)是一種常見的肝臟慢性疾病，其特點是有少量或沒有飲酒史個體的肝臟細(xì)胞中出現(xiàn)過量甘油三酯(TAG)集聚或脂肪變性。NAFLD在西方國家常發(fā)，與肥胖癥，代謝綜合征和2型糖尿病等緊密關(guān)聯(lián)，并且成為肝衰竭的主要原因，通過研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)需要進(jìn)行肝臟移植治療的病例也都有NAFLD的參與。在NAFLD的疾病進(jìn)程中，脂肪酸的代謝異常會觸發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧

2、化反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者Nrf2的表達(dá)量明顯增多。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2可以調(diào)控細(xì)胞對抗外來異物和氧化應(yīng)激引起的損傷，是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2作為機(jī)體防御機(jī)制的關(guān)鍵中樞，可作為治療多種肝臟疾病的藥物作用靶點，如非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、急性肝損傷以及肝癌等。同時，作為NAFLD的疾病特征，膽固醇堆積也能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，從而加重NAFLD程度。在肝臟中，膽固醇7α-羥化酶(cholestero

3、l7α-hydroxylase，CYP7A1)在將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸中主要作用的經(jīng)典合成途徑中，起到限速酶的作用，催化膽汁酸合成的第一步反應(yīng)，從而能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)化成7α-羥化膽固醇。本實驗室前期研究結(jié)果表明，高脂誘導(dǎo)的小鼠發(fā)生NAFLD時藥物代謝酶CYP7A1mRNA的表達(dá)量明顯下降，而Nrf2表達(dá)量升高，且NAFLD模型小鼠肝臟伴隨α-亞麻酸(ALA)和花生四烯酸(AA)的異常升高。為了研究NAFLD疾病進(jìn)程中CYP7A1 mRNA表

4、達(dá)量降低與脂肪酸代謝異常的關(guān)系，以及Nrf2是否調(diào)控CYP7A1的表達(dá)，進(jìn)行了本課題的研究:首先構(gòu)建Nrf2的特異性siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒，然后將Nrf2的特異性siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法瞬時轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，建立HepG2細(xì)胞Nrf2沉默和過表達(dá)模型。在分析ALA和AA兩種脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞對Nrf2和CYP7A1表達(dá)量影響的基礎(chǔ)上，研究ALA和AA誘導(dǎo)對Nrf2沉默和過表達(dá)細(xì)胞CYP7A1的mRNA和蛋白

5、質(zhì)表達(dá)量的影響，探討脂肪酸應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的CYP7A1的變化與Nrf2的相關(guān)性。
　　采用MTT法確定本試驗中ALA和AA的誘導(dǎo)濃度為0.25mmol/L、0.5mmol/L和1 mmol/L。與空白對照組相比，脂肪酸作用誘導(dǎo)后，HepG2細(xì)胞Nrf2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加，且成劑量依賴性;采用ALA誘導(dǎo)后，HepG2細(xì)胞CYP7A1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量成劑量依賴性升高，而采用AA誘導(dǎo)后，HepG2細(xì)胞CYP7A1 m

6、RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量則成劑量依賴性降低。當(dāng)轉(zhuǎn)染si-Nrf2使Nrf2沉默后，ALA和AA誘導(dǎo)CYP7A1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的趨勢與對照組相同，但每個濃度作用下與對照組相比都有所升高，當(dāng)轉(zhuǎn)染Nrf2過表達(dá)質(zhì)粒使Nrf2過表達(dá)后，ALA和AA誘導(dǎo)CYP7A1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的趨勢與對照組相同，但每個濃度作用下與對照組相比卻都有所降低。
　　以上結(jié)果表明，ALA的誘導(dǎo)量與HepG2細(xì)胞CYP7A1的表達(dá)量呈正相關(guān)，而A