冬凌草甲素通過(guò)激活Nrf2通路保護(hù)肝細(xì)胞的研究.pdf

1、冬凌草甲素屬于四環(huán)二萜類化合物，來(lái)自唇形科香茶菜屬植物，我國(guó)是該屬植物資源最豐富國(guó)家。冬凌草甲素具有清熱解毒、消炎止痛及抗腫瘤等作用，市場(chǎng)上又有各種各樣的冬凌草茶用于保健，其作用機(jī)理尚待研究證實(shí)。深入研究其在細(xì)胞內(nèi)促凋亡、抗炎、抗氧化信號(hào)通路作用機(jī)制十分必要。我們選擇了同時(shí)與抗氧化、炎癥和腫瘤密切相關(guān)的Nrf2-Keapl信號(hào)通路，檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)此信號(hào)通路的作用。 肝臟是人體的解毒器官，各種有害物質(zhì)如酒精都是通過(guò)肝臟代謝，會(huì)對(duì)

2、肝細(xì)胞造成一定程度的損傷，目前認(rèn)為氧化損傷是其中重要的機(jī)制。而Nrf2是細(xì)胞降低活性氧，抵御外來(lái)有害刺激的重要轉(zhuǎn)錄因子。正常狀態(tài)下Nrf2與其分子伴侶Keapl結(jié)合于胞漿中，處于功能抑制狀態(tài)，并由Keapl將其帶入泛素化途徑進(jìn)行降解，因此在細(xì)胞中的半衰期很短。在細(xì)胞受到刺激時(shí)，Nrf2從Keapl中解離以穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，Nrf2上具有高度保守的堿性亮氨酸鏈功能域，其堿性區(qū)域能夠與DNA上一段特異序列ARE即抗氧化反應(yīng)元件相結(jié)合促進(jìn)

3、其下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。ARE是抗氧化蛋白和一些二相解毒酶基因上游的一段轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此Nrf2激活后會(huì)產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激、降低腫瘤的易感性、神經(jīng)保護(hù)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、延長(zhǎng)壽命等作用。我們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能夠啟動(dòng)Nrf2下游基因的轉(zhuǎn)錄。冬凌草甲素是從冬凌草中提取出的有效成分，目前有許多有關(guān)其抗腫瘤、炎癥作用的研究，但其是否能夠抗氧化損傷尚不清楚。 目的： 驗(yàn)證冬凌草甲素能夠保護(hù)肝細(xì)胞免于氧化損傷，呈現(xiàn)冬凌草甲素的劑量依

4、賴性。并且證明其抗氧化作用是通過(guò)Nrf2通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，依賴于Nrf2，從而起到保護(hù)肝臟的作用。 方法： 構(gòu)建載體pGL4.22-ARE-TATA-luciferase轉(zhuǎn)染Chang's Liver細(xì)胞，加入冬凌草甲素經(jīng)熒光檢測(cè)證實(shí)其的確能促進(jìn)ARE熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。然后通過(guò)免疫印跡及Real Time PCR法共同證明其上調(diào)了Nrf2和Nrf2下游的基因表達(dá)，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平。在以上結(jié)果都成立的

5、基礎(chǔ)上進(jìn)行反證，即沉默細(xì)胞內(nèi)Nrf2基因，再檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用是否仍然存在。首先構(gòu)建Nrf2-Knock-down載體，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染正常肝細(xì)胞Chang's Liver，篩選出Nrf2-Knock-down Chang's Liver細(xì)胞系。通過(guò)免疫印跡證實(shí)此細(xì)胞系的Nrf2被沉默掉。用冬凌草甲素和酒精作用于構(gòu)建成功Chang's Liver細(xì)胞株，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和培養(yǎng)上清中的AST水平以確定冬凌草甲素是否通過(guò)Nrf2通

6、路保護(hù)肝臟細(xì)胞。 結(jié)果： 冬凌草甲素能增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)，促進(jìn)其下游基因的轉(zhuǎn)錄，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧，減輕酒精對(duì)肝細(xì)胞的損傷。并且將Nrf2沉默后，冬凌草甲素的抗氧化損傷作用消失。說(shuō)明冬凌草甲素對(duì)肝臟細(xì)胞有抗氧化損傷的保護(hù)作用，并且此作用是通過(guò)Nrf2信號(hào)通路的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)論： 冬凌草甲素是細(xì)胞內(nèi)重要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的激活劑，通過(guò)激活Nrf2及其下游基因降低細(xì)胞內(nèi)活性氧，減輕有害物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞造成