冬凌草甲素通過激活Nrf2通路保護肝細胞的研究.pdf

1、冬凌草甲素屬于四環(huán)二萜類化合物，來自唇形科香茶菜屬植物，我國是該屬植物資源最豐富國家。冬凌草甲素具有清熱解毒、消炎止痛及抗腫瘤等作用，市場上又有各種各樣的冬凌草茶用于保健，其作用機理尚待研究證實。深入研究其在細胞內(nèi)促凋亡、抗炎、抗氧化信號通路作用機制十分必要。我們選擇了同時與抗氧化、炎癥和腫瘤密切相關的Nrf2-Keapl信號通路，檢測冬凌草甲素對此信號通路的作用。 肝臟是人體的解毒器官，各種有害物質(zhì)如酒精都是通過肝臟代謝，會對

2、肝細胞造成一定程度的損傷，目前認為氧化損傷是其中重要的機制。而Nrf2是細胞降低活性氧，抵御外來有害刺激的重要轉錄因子。正常狀態(tài)下Nrf2與其分子伴侶Keapl結合于胞漿中，處于功能抑制狀態(tài)，并由Keapl將其帶入泛素化途徑進行降解，因此在細胞中的半衰期很短。在細胞受到刺激時，Nrf2從Keapl中解離以穩(wěn)定狀態(tài)進入細胞核內(nèi)，Nrf2上具有高度保守的堿性亮氨酸鏈功能域，其堿性區(qū)域能夠與DNA上一段特異序列ARE即抗氧化反應元件相結合促進

3、其下游基因的轉錄和表達。ARE是抗氧化蛋白和一些二相解毒酶基因上游的一段轉錄調(diào)控因子。因此Nrf2激活后會產(chǎn)生抗氧化應激、降低腫瘤的易感性、神經(jīng)保護、抗動脈粥樣硬化、延長壽命等作用。我們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能夠啟動Nrf2下游基因的轉錄。冬凌草甲素是從冬凌草中提取出的有效成分，目前有許多有關其抗腫瘤、炎癥作用的研究，但其是否能夠抗氧化損傷尚不清楚。 目的： 驗證冬凌草甲素能夠保護肝細胞免于氧化損傷，呈現(xiàn)冬凌草甲素的劑量依

4、賴性。并且證明其抗氧化作用是通過Nrf2通路來實現(xiàn)的，依賴于Nrf2，從而起到保護肝臟的作用。 方法： 構建載體pGL4.22-ARE-TATA-luciferase轉染Chang's Liver細胞，加入冬凌草甲素經(jīng)熒光檢測證實其的確能促進ARE熒光素酶報告基因的轉錄。然后通過免疫印跡及Real Time PCR法共同證明其上調(diào)了Nrf2和Nrf2下游的基因表達，再用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)氧自由基水平。在以上結果都成立的

5、基礎上進行反證，即沉默細胞內(nèi)Nrf2基因，再檢測其對細胞的保護作用是否仍然存在。首先構建Nrf2-Knock-down載體，通過逆轉錄病毒感染正常肝細胞Chang's Liver，篩選出Nrf2-Knock-down Chang's Liver細胞系。通過免疫印跡證實此細胞系的Nrf2被沉默掉。用冬凌草甲素和酒精作用于構建成功Chang's Liver細胞株，檢測細胞內(nèi)活性氧水平和培養(yǎng)上清中的AST水平以確定冬凌草甲素是否通過Nrf2通

6、路保護肝臟細胞。 結果： 冬凌草甲素能增強肝細胞內(nèi)Nrf2的表達，促進其下游基因的轉錄，降低細胞內(nèi)活性氧，減輕酒精對肝細胞的損傷。并且將Nrf2沉默后，冬凌草甲素的抗氧化損傷作用消失。說明冬凌草甲素對肝臟細胞有抗氧化損傷的保護作用，并且此作用是通過Nrf2信號通路的激活來實現(xiàn)的。 結論： 冬凌草甲素是細胞內(nèi)重要轉錄因子Nrf2的激活劑，通過激活Nrf2及其下游基因降低細胞內(nèi)活性氧，減輕有害物質(zhì)對肝細胞造成