雄激素通過激活Egr1通路調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞生物功能的研究.pdf

1、目的：探究雄激素對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）的體外血管形成能力、遷移能力的影響，及對(duì)體內(nèi)EPC血管新生功能影響。并初步探討了參與這一過程的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：密度梯度離心法提取小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，EBM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化為EPC。DiI染色及流式細(xì)胞術(shù)鑒定分化后 EPC。培養(yǎng)第2天，以含不同濃度雙氫睪酮（DHT）的條件培養(yǎng)基干預(yù)EPC。于第4、5、7、9、11天分別抽取EPC全RNA行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測細(xì)胞中血管內(nèi)

2、皮生長因子（VEGF）表達(dá)量。培養(yǎng)第7天，行體外管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)。制作小鼠下肢缺血模型，以DHT或未處理的EPC局部肌肉注射治療小鼠下肢缺血，激光多普勒檢查評(píng)價(jià)小鼠缺血后肢血流灌注恢復(fù)情況，免疫熒光觀察缺血部位毛細(xì)血管新生密度及GFP標(biāo)記EPC存活量。設(shè)計(jì)早期生長反應(yīng)因子1（Egr1）siRNA干擾片段。進(jìn)行體外管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)，比較DHT處理組及DHT+Egr1 siRN

3、A轉(zhuǎn)染組EPC的血管形成及遷移能力，評(píng)估Egr1是否參與DHT對(duì)EPC血管生成能力及遷移能力的調(diào)控。
　　結(jié)果：DiI染色及流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化的細(xì)胞特征符合EPC特點(diǎn)。RT-PCR結(jié)果顯示DHT以劑量依賴性及時(shí)間依賴性的方式顯著增強(qiáng)EPC中VEGF表達(dá)量，這一增強(qiáng)作用于培養(yǎng)第7天、10nmol/L濃度達(dá)到高峰（P<0.05）。體外管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 DHT以劑量依賴性的方式顯著增

4、強(qiáng) EPC的血管形成能力及遷移能力（P<0.05），且這一增強(qiáng)作用于10nmol/L濃度達(dá)到最強(qiáng)。小鼠下肢缺血模型制作成功，激光多普勒檢測顯示DHT處理的EPC治療的小鼠下肢血流灌注恢復(fù)明顯較未處理 EPC組及對(duì)照組為高（P<0.05），免疫熒光結(jié)果顯示注射DHT處理的EPC組缺血部位毛細(xì)血管新生密度顯著高于未處理EPC組及對(duì)照組，EPC存活率高于未處理EPC組（P<0.05）。Egr1 siRNA設(shè)計(jì)成功，EPC轉(zhuǎn)染Egr1 siRN

5、A效率高于90%，轉(zhuǎn)染后Egr1基因表達(dá)抑制率達(dá)60%（P<0.05）。體外管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示，10nmol/L DHT+Egr1-siRNA轉(zhuǎn)染組EPC的血管形成能力及遷移能力較單純10nmol/L DHT處理組均明顯下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)顯示DHT以劑量依賴性的方式顯著增強(qiáng)EPC的血管形成能力及遷移能力，這一增強(qiáng)作用于10nmol/L濃度達(dá)到最強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示 DHT增強(qiáng)E