雄激素調(diào)控VR-VEGF-Cyclin A通路誘導主動脈內(nèi)皮細胞保護效應.pdf

1、目的:目前越來越多的臨床研究結(jié)果支持內(nèi)源性雄激素在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。內(nèi)源性雄激素水平的降低與心血管病的發(fā)生及死亡率升高有關。由于血管內(nèi)皮的損傷是啟動動脈粥樣硬化、斑塊形成及血液凝結(jié)等心血管疾病的關鍵環(huán)節(jié)，雄激素的心血管保護效應可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮增殖、修復密切相關。本研究探討生理劑量范圍的雄激素作用于男性動脈內(nèi)皮細胞的相關靶基因改變及其分子調(diào)控機制，同時探討調(diào)控靶基因所產(chǎn)生的生物學效應。
　　 方法:采用睪酮(te

2、stosterone，T)、二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)及雌二醇（17β-estradiol，β-E2）干預原代男性動脈內(nèi)皮細胞(human aortic endothelial cells，HAECs)，采用實時定量聚合酶鏈式反應(Realtime-qPCR)檢測激素干預后雄激素受體(androgen receptor，AR)，細胞周期素A(cyclins A)，細胞周期素D1(cyclins D1)及血

3、管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因表達的變化。采用蛋白質(zhì)印記法(Western blot)檢測細胞內(nèi)雄激素受體蛋白的水平。采用電化學熒光法檢測細胞培養(yǎng)液中VEGF濃度。研究雄激素對細胞增殖的量-效和時-效反應。采用細胞增殖活細胞數(shù)量檢測及DNA復制活性檢測分析激素對細胞增殖的影響。通過藥物阻斷的方法和RNA干擾的方法阻斷靶基因的功能以研究雄激素調(diào)控HAEC細胞增殖的信號

4、傳導通路:(1)應用雄激素受體拮抗劑casodex及AR siRNA阻斷AR的作用;(2)應用VEGFR拮抗劑SU5416及 VEGF-A siRNA阻斷VEGF的作用;(3)應用細胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CKD）抑制劑roscovitine阻斷CKD與cyclin結(jié)合，檢測細胞增殖及相關基因和蛋白的關系。
　　 結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)二氫睪酮可促進HAEC中AR、VEGF、cyclinA及c

5、yclinD1 mRNA表達增加。采用Casodex可抑制雄激素增加AR、VEGF、cyclinA、cyclinD1 mRNA表達及AR、VEGF蛋白表達的升高。SU5416及VEGF-A siRNA可阻斷cyclin A mRNA表達升高;然而SU5416對HAEC中VEGF mRNA表達及細胞培養(yǎng)液的VEGF濃度無明顯影響，而VEGF-A siRNA則可阻斷雄激素增加VEGF的濃度;應用roscovitine可阻斷二氫睪酮誘導VEG

6、F mRNA表達升高。
　　 雄激素睪酮及二氫睪酮從1 nmol/L到50 nmol/L可促進HAEC細胞增殖及DNA合成，此增殖效應呈劑量和時間依賴性。而17β-雌二醇從0.1nmol/L到1μmol/L均無促進HAEC細胞增殖的效果。然而17β-雌二醇可阻斷二氫睪酮誘導的HAEC細胞增殖。采用Casodex及AR siRNA均可阻斷二氫睪酮誘導的HAEC細胞增殖效應及DNA合成。SU5416及VEGF-A siRNA可阻斷二

7、氫睪酮誘導的HAEC細胞增殖及DNA合成;應用roscovitine可阻斷二氫睪酮誘導的HAEC細胞增殖及DNA的合成。雖然dutasteride可抑制5α-還原酶活性而阻斷睪酮轉(zhuǎn)為二氫睪酮，但dutasteride在濃度100～1000 nmol/L的范圍內(nèi)均不能阻斷睪酮誘導HAEC細胞增殖的效應。
　　 結(jié)論:本研究顯示二氫睪酮通過作用于雄激素受體(AR)調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與細胞周期素-細胞周期依賴性激酶（Cy

8、clin-CKD）從而發(fā)揮促進男性動脈內(nèi)皮細胞增殖的作用。雄激素睪酮及二氫睪酮均可產(chǎn)生濃度和時間依賴性地促進男性HAEC細胞增殖及DNA的合成，二氫睪酮通過作用于AR上調(diào)VEGF基因的表達，而促進男性HAEC細胞的增殖;此增殖過程同時受到cyclin-CDK的調(diào)控;二氫睪酮促進HAEC細胞增殖過程中VEGF及cyclin A可能存在環(huán)路式調(diào)控系統(tǒng)。17β-雌二醇無促進男性HAEC細胞增殖的效果，但能阻斷二氫睪酮的作用，其機制有待進一步研