人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜分析.pdf

1、背景：
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosisAS)是動(dòng)脈硬化中最常見(jiàn)、最重要的一種，因其基本損害從動(dòng)脈內(nèi)膜開(kāi)始局部呈斑塊狀增厚，也被稱為動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率很高，近年來(lái)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。它是一種復(fù)雜的多因素疾病，其發(fā)病機(jī)制和確切病因尚未完全闡明。動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞層能感知血液中的切應(yīng)力、壓力、炎性信號(hào)、激素水平等信息，通過(guò)釋放活性物質(zhì)對(duì)這些信息作出反應(yīng)，維持血管壁張力、血液流動(dòng)、屏障、管壁的炎癥修復(fù)和血管增生等功

2、能，其作為動(dòng)脈粥樣硬化開(kāi)始的起始部，內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙或損傷在動(dòng)脈粥樣硬化中起到了重要的作用。冠狀動(dòng)脈近側(cè)段好發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化可能與內(nèi)皮異質(zhì)性相關(guān)，長(zhǎng)期環(huán)境因素的影響可能使不同部位的內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)不同。目前，關(guān)于不同種類動(dòng)脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮基因表達(dá)的研究主要偏重于特定的基因，從整體研究基因表達(dá)的改變并不多見(jiàn)。基因芯片可以用少量樣品在一次試驗(yàn)中同時(shí)平行分析成千上萬(wàn)個(gè)基因，從整體宏觀的角度研究生物體基因的表達(dá)及功能。目前，基因芯片技術(shù)已廣

3、泛應(yīng)用于基因測(cè)序、基因表達(dá)譜分析、基因突變及多態(tài)性分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、藥物篩選、疾病診斷和分型等。本課題主要利用基因芯片技術(shù)分析冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜，篩選出表達(dá)差異的基因，探討相關(guān)的功能和信號(hào)通路。
　　目的：
　　芯片技術(shù)分析冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜，篩選出表達(dá)差異的基因，探討相關(guān)的功能和信號(hào)通路。
　　方法：
　　提取冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HA

4、EC)株的總RNA，純化后逆轉(zhuǎn)錄制備雜交探針，采用Agilent公司人基因組寡聚核苷酸芯片篩選差異表達(dá)基因，然后采用DAVID功能注釋生物信息學(xué)芯片分析系統(tǒng)對(duì)P值小于0.05且差異表達(dá)大于2倍的基因進(jìn)行基因富集分析，并用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡(Westernblot)驗(yàn)證部分篩選基因的表達(dá)。選取基因EDN1、OCLN構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到HCAEC中，用G418篩選出穩(wěn)定株，用Westernblot方法驗(yàn)證并檢測(cè)過(guò)

5、表達(dá)后對(duì)部分基因的影響。然后用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)作出生長(zhǎng)曲線圖，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，探討EDN1、OCLN對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞相比，冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)在兩倍以上，P值小于0.05的差異點(diǎn)有2435個(gè)，其中1198個(gè)基因上調(diào)，1237個(gè)基因下調(diào)。GO分類后可見(jiàn)差異表達(dá)基因涉及細(xì)胞增殖、分化、粘附、炎癥反應(yīng)、脂代謝、免疫反應(yīng)、宿主防御、應(yīng)激反應(yīng)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及血管生成和細(xì)胞凋

6、亡等多個(gè)基因及信號(hào)通路;Pathways分析后可以得出參與較多基因的信號(hào)通路，主要涉及腫瘤途徑、細(xì)胞因子間受體相互作用、MAPK信號(hào)途徑、粘附分子、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、內(nèi)吞作用、ECM受體相互作用、Jak-STAT信號(hào)途徑等。實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證的部分基因與芯片結(jié)果一致。成功構(gòu)建了EDN1、OCLN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到HCAEC中，在蛋白水平，Westernblot結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)后的表達(dá)量增高。MTT結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)后對(duì)HCAEC的生長(zhǎng)抑制，用

7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示S期細(xì)胞減少，通過(guò)細(xì)胞周期抑制增殖。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用表達(dá)譜基因芯片成功篩選出冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)基因，經(jīng)生物學(xué)信息分析主要涉及細(xì)胞增殖、分化、粘附、炎癥反應(yīng)、脂代謝、免疫反應(yīng)、宿主防御、應(yīng)激反應(yīng)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及血管生成和細(xì)胞凋亡等多個(gè)基因及信號(hào)通路，可能為研究冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制及防治提供新思路?；駿DN1、OCLN過(guò)表達(dá)后對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響可能與細(xì)胞周期阻滯