山藥提取物對(duì)人冠狀動(dòng)脈與主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TIPE2與PCNP基因表達(dá)的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）是一類主要累及大、中動(dòng)脈的動(dòng)脈硬化性疾病，表現(xiàn)為動(dòng)脈的內(nèi)膜層的脂質(zhì)沉積、脂紋形成、粥樣斑塊、斑塊破裂出血、血栓形成等一系列病理變化，最終導(dǎo)致血管管腔慢性狹窄甚至血栓形成發(fā)生急性閉塞，危及生命。隨著其發(fā)病率的逐年增加，科學(xué)家對(duì)AS的研究也越來越深入、越來越廣泛，發(fā)病機(jī)制眾說紛紜，但目前得到廣泛認(rèn)同的主要有兩種學(xué)說：炎癥學(xué)說和內(nèi)皮損傷學(xué)說，認(rèn)為炎癥因子和免疫反應(yīng)在AS發(fā)病的整個(gè)過程中均起

2、到至關(guān)重要的作用。
　　山藥營養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉，既能作為食物供人們食用，又能作為藥物用于疾病的治療，自古以來都受到人們的喜愛。以山藥提取物（Dioscorease rhizome extract, DRE）為主要成分的藥物制品也已在臨床應(yīng)用多年，主要用于高血脂、冠心病等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的預(yù)防與治療。但在臨床上缺乏大型的臨床試驗(yàn)為其提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，在分子機(jī)制方面的研究更是少有，因此山藥抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制尚不明確。
　　P

3、CNP（PEST-containing nuclear protein）是一類新近發(fā)現(xiàn)的核蛋白，也是一種親水性的蛋白，其結(jié)構(gòu)中富含PEST序列，是NIRF的底物，容易被NIRF介導(dǎo)泛素化，從而被蛋白酶降解，因此其半衰期較短，相對(duì)較不穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，PCNP參與細(xì)胞周期的調(diào)控過程及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展中可能也起到一定的調(diào)節(jié)作用。TIPE2（tumor necrosisfactor-α-induced pr

4、otein8-like2）是新近發(fā)現(xiàn)的對(duì)細(xì)胞凋亡起調(diào)節(jié)作用的蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)先天性免疫及獲得性免疫具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，并參與維持機(jī)體的免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)。由于在抗菌免疫機(jī)制中亦產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用，過表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)細(xì)菌感染后炎癥反應(yīng)的發(fā)生，造成嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TIPE2參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程。近期的研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中的TIPE2通過對(duì)免疫反應(yīng)起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程具有一定的抑制作用。
　　本實(shí)驗(yàn)預(yù)從D

5、RE入手，探討在人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cell, HCAEC）及主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cell, HAEC）中PCNP與TIPE2的表達(dá)量是否隨著DRE濃度的變化而變化，以及兩種細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)是否有差異，為進(jìn)一步研究DRE與AS的關(guān)系及新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　目的:通過檢測(cè)HCAEC及HAEC內(nèi)PCNP與TIPE2

6、的表達(dá)量隨DRE濃度的變化情況，探討DRE與AS的關(guān)系。
　　方法:將DRE用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液完全溶解制得10mg/ml的DRE原液，再將DRE原液稀釋為如下三種濃度：1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，分別培養(yǎng)HCAEC及HAEC24h、48 h、72 h，并設(shè)置對(duì)照組（0μg/ml）。通過MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，檢測(cè)不同濃度DRE對(duì)兩種細(xì)胞生長的影響；提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR（R

7、eal time-PCR，RT-PCR）法檢測(cè)不同濃度DRE培養(yǎng)兩種細(xì)胞，經(jīng)過不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)PCNP和TIPE2基因表達(dá)的變化；通過免疫印跡法（Western Blotting）檢測(cè)經(jīng)過DRE培養(yǎng)后HCAEC和HAEC細(xì)胞內(nèi)PCNP和TIPE2蛋白的表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:MTT結(jié)果顯示：不同濃度的DRE對(duì)HCAEC和HAEC細(xì)胞的生長未產(chǎn)生明顯影響（P＞0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示：PCNP的表達(dá)量不受藥物濃度、細(xì)胞種類

8、及培養(yǎng)時(shí)間的影響（P＞0.05），TIPE2的表達(dá)量不受細(xì)胞種類及培養(yǎng)時(shí)間的影響（P＞0.05），與DRE濃度呈正相關(guān)，濃度越大TIPE2表達(dá)量越多，相反濃度越小TIPE2表達(dá)量越少（P＜0.05）；Western Blotting結(jié)果顯示：PCNP蛋白表達(dá)量不受藥物濃度、細(xì)胞種類及培養(yǎng)時(shí)間的影響（P＞0.05），TIPE2蛋白表達(dá)量不受細(xì)胞種類及培養(yǎng)時(shí)間的影響（P＞0.05），與DRE濃度有關(guān)，濃度越大TIPE2表達(dá)量越多（P＜0.0