雌激素受體配體對(duì)二氫睪酮誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　1.研究不同雌激素受體配體和雄激素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響;
　　2.探討不同雌激素受體配體對(duì)雄激素作用的影響。
　　方法:
　　1.采用人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，分別以不同濃度的α雌二醇、β雌二醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、染料木黃酮培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力;qRT-PCR方法檢測(cè)cyclin A和VEGF mRNA表達(dá)水平，MSD化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)VEGF分泌水平，比較α雌二醇和β雌二醇對(duì)VEGF

2、、cyclin A基因表達(dá)的影響。RT-PCR和Western blot檢測(cè)雌激素受體α和雌激素受體β在mRNA和蛋白水平的表達(dá);激素受體α激動(dòng)劑PPT和雌激素受體β激動(dòng)劑DPN干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，比較PPT和DPN對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　2.用不同濃度的二氫睪酮干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)(0h，24h，48h)，用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，確定二氫睪酮干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的最佳濃度和時(shí)間。用不同濃度二氫睪

3、酮(5nM，10nM)干預(yù)入主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，qRT-PCR、MSD化學(xué)發(fā)光和Western blot方法檢測(cè)雄激素受體、VEGF、cyclin A和cyclin D的mRNA和蛋白表達(dá)水平，比較雄激素受體、VEGF、cyclin A、cyclinD基因表達(dá)水平的變化。采用siRNA干擾的方法沉默雄激素受體的表達(dá)，在二氫睪酮10nM溶液中培養(yǎng)48小時(shí)，以非特異性siRNA干擾組為對(duì)照，了解二氫睪酮的促人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。

4、r>　　3.分別用不同濃度的α雌二醇、β雌二醇、乙烯雌酚、染料木黃酮、他莫昔芬、氟維司群、PPT、DPN聯(lián)合二氫睪酮10nM培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，設(shè)單純二氫睪酮10 nM為陽性對(duì)照組，了解各種雌激素受體配體對(duì)二氫睪酮促人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響，同時(shí)比較雌激素受體α激動(dòng)劑、雌激素受體β激動(dòng)劑對(duì)二氫睪酮促人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響。
　　結(jié)果:
　　1.α雌二醇、β雌二醇、乙烯雌酚、

5、他莫昔芬、染料木黃酮對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響:α雌二醇10nM組和100 nM組細(xì)胞增殖活力顯著高于對(duì)照組，分別增加24％(P＜0.05)和31％(P＜0.05)，100 nM組較10nM組增加更明顯，呈劑量依賴趨勢(shì);β雌二醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、染料木黃酮組，細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　α雌二醇和β雌二醇對(duì)VEGF、cyclin A表達(dá)的影響:α雌二醇100nM組cyclin A mRNA的表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)6

6、0％(P＜0.05)，VEGF的表達(dá)較對(duì)照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。β雌二醇100 nM組cyclin A和VEGF的表達(dá)較對(duì)照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　雌激素受體α、β亞型在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用:ERα激動(dòng)劑PPT0.05 nM，0.1 nM和1nM組，細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組增加，其中PPT1 nM細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組增加24％，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。ERβ激動(dòng)劑DPN0.05 nM，0.1 nM和1nM組，細(xì)胞增殖

7、活力較對(duì)照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.二氫睪酮對(duì)入主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響:干預(yù)入主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，自二氫睪酮5 nM濃度開始，細(xì)胞增殖活力顯著增加，呈劑量依賴趨勢(shì)。干預(yù)48小時(shí)較干預(yù)24小時(shí)，細(xì)胞增殖活力增加更明顯，呈時(shí)間依賴趨勢(shì)。
　　二氫睪酮對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞雄激素受體(AR)、VEGF、cyclinA和cyclin D基因表達(dá)的影響:二氫睪酮5 nM和10nM干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，AR、VEGF、cy

8、clin A和cyclin D mRNA表達(dá)上調(diào)，二氫睪酮10nM組上調(diào)更明顯(P＜0.05)，呈劑量依賴趨勢(shì)。二氫睪酮10nM組，AR蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P＜0.05)。二氫睪酮5 nM組和10nM組，VEGF分泌水平較對(duì)照組顯著增加(13.38±2.95ng/ml vs.25.55±2.49 ng/ml vs.3.52±0.87 ng/ml, p＜0.05)。
　　雄激素受體在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用:雄激素受體si

9、RNA200 nM可顯著下調(diào)雄激素受體的表達(dá)(＞90％)。雄激素受體siRNA200 nM干擾后，二氫睪酮10nM培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，細(xì)胞增殖活力和DNA合成較相應(yīng)非特異性siRNA組顯著下降(P＜0.05)。
　　3.不同雌激素受體配體對(duì)二氫睪酮誘導(dǎo)的入主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響:α雌二醇（10nM和100 nM）、染料木黃酮(1μM)和PPT（0.05 nM、0.1 nM和1 nM）聯(lián)合二氫睪酮10nM組，較單純二氫睪

10、酮10nM組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;β雌二醇(1nM、10nM和100nM)、乙烯雌酚（1nM、10nM和100 nM）、他莫昔芬（100 nM）、氟維司群（100nM和1000 nM）和DPN（0.05 nM、0.1 nM和1 nM）聯(lián)合二氫睪酮10nM組較單純二氫睪酮10 nM組細(xì)胞增殖活力顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1.不同雌激素受體配體對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響具有差異性。α雌二醇和PPT促進(jìn)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖;β雌二

11、醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、染料木黃酮、氟維司群和DPN對(duì)入主動(dòng)脈內(nèi)皮的增殖無明顯影響。
　　2.二氫睪酮通過雄激素受體途徑促進(jìn)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并上調(diào)VEGF和cyclin A和cyclin D的表達(dá)。
　　3.不同雌激素受體配體對(duì)二氫睪酮的促人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響具有差異性。α雌二醇、染料木黃酮和PPT對(duì)二氫睪酮誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖無抑制作用;而β雌二醇、乙烯雌酚、他莫昔芬、氟維司群和DPN抑制了二氫睪酮誘導(dǎo)的