雌二醇與二氫睪酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響和機(jī)制研究.pdf

1、目的:1.研究二氫睪酮對不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響;
　　2.探討二氫睪酮調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制;
　　3.研究不同雌激素對雄激素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響。
　　方法:
　　1.分別用不同濃度二氫睪酮培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)，MTS檢測細(xì)胞增殖活力;分別將不同劑量雄激素受體(AR) siRNA或AR抑制劑Casodex與二氫睪酮10nM聯(lián)合培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)

2、，分析二氫睪酮誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖與雄激素受體的關(guān)系。
　　2.分別收集不同時(shí)間段LAPC-4和LNCaP細(xì)胞條件培養(yǎng)基(TCM)稀釋成不同濃度培養(yǎng)小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，MTS法檢測細(xì)胞增殖活力;用不同劑量二氫睪酮預(yù)處理LAPC-4和LNCaP細(xì)胞，48小時(shí)后收集TCM干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞，MTS法檢測細(xì)胞增殖活力;采用VEGFR抑制劑SU5416聯(lián)合相應(yīng)TCM培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)或48小時(shí)，用MTS方法檢測細(xì)胞增殖活力;采用

3、MDS法、實(shí)時(shí)定量PCR法分別檢測相應(yīng)TCM中VEGF-A濃度和細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)水平，分析VEGF/VEGFR通路在二氫睪酮誘導(dǎo)的小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用。
　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):單用或合用二氫睪酮、17α-雌二醇或17β-雌二醇培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，MTS法檢測細(xì)胞活力;單用或合用二氫睪酮、17α-雌二醇或17β-雌二醇培養(yǎng)LAPC-4細(xì)胞48小時(shí)，收集TCM，用MDS法檢測TCM中VEGF濃度，并用TCM

4、干預(yù)小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)，MTS法檢測細(xì)胞活力。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn):分別建立LAPC-4和LNCaP細(xì)胞異種移植的小鼠模型，將建模成功的小鼠隨機(jī)分為安慰劑組、17α-雌二醇組和17β-雌二醇組，干預(yù)4周后處死小鼠收集移植組織，采用免疫組化法檢測血管CD31的表達(dá)量，分析雌激素對微血管生成的影響。
　　結(jié)果:
　　1.二氫睪酮對不同來源內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響:二氫睪酮1 nM～50 nM組人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力較對

5、照組增加，該增殖效應(yīng)呈時(shí)間和劑量依賴性趨勢。二氫睪酮對小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖無明顯影響。二氫睪酮10nM組HAECs遷移數(shù)較對照組增加(p＜0.01)。
　　雄激素受體介導(dǎo)二氫睪酮誘導(dǎo)的入主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖:與二氫睪酮10nM相比，Casodex1μM～10μM聯(lián)合二氫睪酮10nM干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力顯著降低(p＜0.01);二氫睪酮10nM可顯著促進(jìn)非特異性siRNA轉(zhuǎn)染后人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和對照組細(xì)胞的增殖活力(p＜0.01)

6、，對AR siRNA轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮細(xì)胞增殖無明顯影響(p＞0.05)。
　　2.二氫睪酮通過微環(huán)境促進(jìn)小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖:LAPC-4和LNCaP細(xì)胞TCM可時(shí)間和濃度依賴性地誘導(dǎo)小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖;二氫睪酮0.1nM到50nM預(yù)處理后的TCM(DHT-TCM)較對照組TCM內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力明顯增加(p＜0.05)。
　　二氫睪酮誘導(dǎo)的小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與VEGF/VEGFR信號的相關(guān)性:收集時(shí)間點(diǎn)為24小時(shí)和48小

7、時(shí)的LAPC-4細(xì)胞TCM中VEGF濃度分別是12.43ng/ml和28ng/ml;但DHT-TCM和對照組TCM相比，各組間VEGF濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。SU541610μM可完全抑制相應(yīng)TCM誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖(p＜0.01)。
　　3.雌二醇聯(lián)合二氫睪酮對人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響:17β-雌二醇聯(lián)合二氫睪酮組人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力較單用DHT10nM組顯著降低(p＜0.05)，而17α-雌二醇聯(lián)合組與單用

8、DHT10nM組對比細(xì)胞活力無明顯差異(p＞0.05)。
　　雌二醇聯(lián)合二氫睪酮對小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響:單用或合用二氫睪酮、17α-雌二醇或17β-雌二醇對小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖無明顯直接影響。17α-雌二醇1μM或17β-雌二醇1μM可通過LAPC-4和LNCaP細(xì)胞抑制二氫睪酮10nM誘導(dǎo)的小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖(p＜0.01)。
　　雌二醇對小鼠微血管生成的影響:在LAPC-4異種移植小鼠中，17α-雌二醇組和

9、17β-雌二醇組微血管數(shù)目較安慰劑組分別減少18％(p＜0.05)和19％(p＜0.05)，在LNCaP前列腺癌小鼠中微血管數(shù)目可分別減少57.7％(p＜0.01)和60.2％(p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.二氫睪酮對不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有差異性。
　　2.二氫睪酮可分別通過雄激素受體(AR)和微環(huán)境誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，微環(huán)境中VEGFR通路是二氫睪酮誘導(dǎo)的內(nèi)皮增殖效應(yīng)的重要通路。
　　3.雌二醇影響二