GPERshRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建人和小鼠共用的G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G-protein-coupled receptor30，GPER)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒，鑒定其對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human vascular endothelial cells，HVECs)和小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞(mouse vascular endothelial cells，MVECs)GPER表達(dá)的影響，并觀察其對(duì)人與

2、小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法：
　　 設(shè)計(jì)并體外合成靶向(人和小鼠)基因GPER的特異性編碼短發(fā)卡RNA(short hair RNA，shRNA)序列的寡核苷酸，同時(shí)合成一對(duì)錯(cuò)義的非特異性序列作為陰性對(duì)照，退火，連接到經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ；HindⅢ酶切處理的線性化pSUPER質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆，抽提重組質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切電泳及測(cè)序鑒定，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒

3、；培養(yǎng)人與小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，ECs)，進(jìn)而將構(gòu)建的三組重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染人和小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)各組GPER蛋白水平的表達(dá)，用MTT法檢測(cè)構(gòu)建重組質(zhì)粒對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞及小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：
　　 GPER shRNA重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序分析表明：目的核苷酸序列成功插入了預(yù)計(jì)位點(diǎn)且序列完全一致；<

4、br>　　 轉(zhuǎn)染了GPER shRNA質(zhì)粒的人血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，與對(duì)照組相比均可下調(diào)GPER蛋白的表達(dá)(P<0.05)，其中GPER shRNA2質(zhì)粒的抑制作用較強(qiáng)，轉(zhuǎn)染48 h后GPER蛋白的抑制率可最高可達(dá)到84.2％；
　　 構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人與小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞后，可顯著抑制(人與小鼠)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建同時(shí)靶向人和小鼠GPER的RNA干擾重組載體；構(gòu)建成功