構(gòu)建Gab1特異RNAi慢病毒載體及其對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建針對人類生長因子受體結(jié)合蛋白2相關(guān)的接頭蛋白1(Grb2-AssociatedBinder1,Gab1)基因的慢病毒干擾載體,從轉(zhuǎn)錄后水平抑制Gab1基因的表達(dá),并將構(gòu)建的慢病毒RNA干擾載體載染人血管內(nèi)皮細(xì)胞,研究沉默細(xì)胞內(nèi)Gab1基因表達(dá)后對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　方法：
　　針對人類Gab1基因設(shè)計(jì)5個(gè)靶點(diǎn)的SiRNA序列,并分別合成靶序列的OligoDNA,退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)HpaI和X

2、hoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后的GV118載體連接,產(chǎn)生Gab1-RNAi重組質(zhì)粒,PCR篩選陽性克隆并進(jìn)行測序鑒定。將各個(gè)靶點(diǎn)的重組質(zhì)粒與構(gòu)建的Gab1過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過Western-bolt檢測Gab1蛋白表達(dá)水平來篩遷最佳干擾靶點(diǎn)的重組質(zhì)粒,再將最佳的Gab1-RNAi重組質(zhì)粒、pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生LV-Gab1-RNAi慢病毒并測定其滴度。并將獲得的慢病毒分別載

3、染EA.hy926細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況,測定其轉(zhuǎn)染效率;通過RT-PCR和Western-bolt檢測轉(zhuǎn)染后的EA.hy926細(xì)胞中Gab1mRNA和蛋白表達(dá)水平來驗(yàn)證慢病毒干擾載體的基因沉默效率。將構(gòu)建好的慢病毒干擾載體載染EA.hy926細(xì)胞,在細(xì)胞接種后第1、2、3、4、5d利用MTT分析方法檢測其對細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1、篩選陽性克隆經(jīng)PCR及測序鑒定,成功將Gab1靶向含shRNA

4、的雙鏈DNA序列插入GV118載體中即Gab1-RNAi重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2、包裝產(chǎn)生的LV-Gab1-RNAi慢病毒載染293T細(xì)胞,測定的滴度為3×109TU/ml。
　　3、RT-PCR和Western Blot檢測RNAi慢病毒載染后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中目的基因表達(dá)水平,證實(shí)構(gòu)建的慢病毒干擾載體可以高效抑制Gab1基因的表達(dá)。
　　4、沉默血管內(nèi)皮細(xì)胞中Gab1基因表達(dá)后,細(xì)胞增殖受到明顯的抑制。