Notch1特異的RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的： 構(gòu)建針對(duì)Notch-1基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制Notch-1基因表達(dá)，為研究Notch-1信號(hào)通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAi慢病毒感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，觀察抑制Notch-1信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y增殖的影響。 方法： 設(shè)計(jì)合成兩對(duì)針對(duì)Notch-1 mRNA不同位點(diǎn)的shRNA編碼序列，克隆到慢病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過(guò)Ga

2、teway重組構(gòu)建重組RNAi慢病毒表達(dá)載體；在293FT細(xì)胞中包裝并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，獲得高滴度的病毒上清；慢病毒感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，RT-PCR和Western Blot檢測(cè)構(gòu)建的RNAi慢病毒對(duì)Notch-1表達(dá)的抑制效果；利用RNAi慢病毒抑制Notch-1表達(dá)，探討Notch-1信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y增殖的影響。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建了針對(duì)Notch-1基因兩個(gè)不同位點(diǎn)的RNA

3、i慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定干擾片段的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確； 2、在293FT細(xì)胞中包裝，獲得高滴度慢病毒上清；病毒液滴度在1.5×105TU-2.3×105TU之間，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要； 3、構(gòu)建的兩個(gè)RNAi慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞后可使Notch-1mRNA表達(dá)量分別下降80％和66％； 4、慢病毒感染SH-SY5Y后進(jìn)行MTT檢測(cè)，RNAi慢病毒組與無(wú)義干擾組和對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖率明顯