CALR基因在MDS患者中的表達及其RNAi慢病毒載體對細胞生長和凋亡的影響.pdf

1、目的：研究骨髓增生異常綜合征(MDS)患者中鈣網(wǎng)織蛋白基因(Calreticulin, CALR)的表達，并構(gòu)建CALR-RNAi慢病毒載體，觀察其對人MDS細胞株SKM-1細胞生長和凋亡的影響。
　　方法：收集重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科2010年~2014年的34例MDS患者骨髓標本和8例非MDS患者骨髓標本。按照WHO分型診斷標準和MDS國際預后積分系統(tǒng)，將實驗組34例患者分為高危組和低危組，對照組取另外8例同期非MDS患

2、者的骨髓標本。所有骨髓標本通過分離單個核細胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備為cDNA，使用RT-PCR技術(shù)檢測兩組骨髓標本及SKM-1細胞中CALR的相對表達水平。
　　首先查詢GenBank中CALR（human）的堿基序列，然后使用RNAi軟件設(shè)計3條RNAi靶序列、1條陰性對照序列。合成RNAi靶序列的單鏈DNA oligo，退火配對產(chǎn)生雙鏈，T4 DNA連接酶連接酶切后的慢病毒載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，PCR篩選陽性克隆并進行測

3、序鑒定，完成RNAi慢病毒載體的制備。共轉(zhuǎn)染293T細胞進行包裝得到3種GV-CALR-RNAi重組慢病毒載體。病毒滴度采用逐孔稀釋法進行測定。
　　三種GV-CALR-RNAi重組慢病毒分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SKM-1細胞中，通過流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。后收集各組細胞，分別提取總RNA及蛋白，通過RT-PCR檢測各組細胞CALR mRNA表達及Western blot技術(shù)檢測各組細胞CALR蛋白質(zhì)的表達以驗證干擾效果，篩選出最佳靶向序列

4、。使用含最佳靶向序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)染SKM-1細胞，CCK-8法檢測干擾CALR基因的表達對SKM-1細胞生長的影響，流式細胞術(shù)觀察其對細胞周期的影響，Annexin V/7-AAD雙染法用流式細胞術(shù)觀察對細胞凋亡的影響，Western blot檢測凋亡蛋白caspase-3的水平。
　　結(jié)果：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測34例低、高危MDS標本的CALR表達，絕大多數(shù)標本CALR基因表達明顯降低，顯著低于正常對照組（P<0.01）。

5、同時，檢測到人MDS細胞株SKM-1細胞中CALR表達較正常對照明顯降低（P<0.01）
　　構(gòu)建的3組 CALR-RNAi重組慢病毒轉(zhuǎn)染人 MDS細胞株SKM-1后，倒置顯微鏡下觀察GFP熒光逐漸增強，至培養(yǎng)第5天表達最強， CALR-RNAi(2)、CALR-RNAi(3)慢病毒干擾組流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率均在70％以上，而CALR-RNAi(1)慢病毒干擾組流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率在50%以下。
　　RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染

6、后第5天實驗組 CALR-mRNA表達水平，結(jié)果顯示CALR-RNAi(3)慢病毒載體與陰性對照組及空白對照組相比能有效降低 CALR mRNA表達水平[(0.40±0.11)，P＜0.01］。Western blot檢測結(jié)果也證實，CALR-RNAi(3)能有效敲除CALR蛋白的表達，確定為最佳靶點
　　在SKM-1細胞中轉(zhuǎn)染CALR-RNAi（3）慢病毒及陰性對照組慢病毒，通過CCK-8法檢測SKM-1細胞的生長，發(fā)現(xiàn)CALR

7、-RNAi(3)通過干擾CALR表達可促進SKM-1細胞生長，細胞生長第5天統(tǒng)計學差異顯著（P<0.05）。流式細胞術(shù)檢測實驗組和對照組細胞周期情況，結(jié)果顯示CALR-RNAi(3)組G0/G1期細胞比例（45.25±4.45）%低于空白對照組（54.12±1.36）%和陰性對照組（54.67±1.26）%，且差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.019，P=0.014）；而CALR-RNAi(3)組S期細胞比例細胞比例為（46.15±2.99）

8、，明顯高于空白對照組和陰性對照組[(38.42±2.11)%和（36.23±3.25）%，P<0.05。 AnnexinV/7-AAD雙染法用流式細胞儀檢測凋亡細胞，發(fā)現(xiàn)CALR-RNAi(3)組較陰性對照組和空白對照組細胞凋亡減少（圖7），且有顯著性差異（P<0.05）。用Western blot檢測各組細胞中cleaved-caspase-3的表達。結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比， cleaved-caspase-3的表達在