慢病毒介導(dǎo)血友病B基因在離體細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)血友病B基因在離體細(xì)胞中的表達(dá)姓名：閆冬梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（血液病）指導(dǎo)教師：徐開林;潘秀英20060501徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)血友病B 基因在離體細(xì)胞中的表達(dá)中文摘要目的：構(gòu)建泛醌啟動(dòng)子( P U B ) 驅(qū)動(dòng)的攜帶狗凝血因子I X ( c F I X ) 基因的慢病毒三質(zhì)粒表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞( M S C s ) 和人胚腎細(xì)胞( 2 9 3 T ) ，觀察轉(zhuǎn)染后是

2、否能獲得有效的c F I X 表達(dá)，為臨床基因治療血友病B 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用限制性內(nèi)切酶酶切載體P T K 6 8 ’，獲得c F I X 基因片斷，并連接至慢病毒載體P T K l 5 1 ( 含P U B 啟動(dòng)子) ，重組質(zhì)粒命名為P T K l 6 4 。采用改良的磷酸鈣沉淀法將包裝質(zhì)?！鱊 R f 、包膜蛋白質(zhì)粒V S V - G 和構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒P T K l 6 4 共轉(zhuǎn)染2 9 3 T 包裝細(xì)胞，7 2 小時(shí)后

3、收集病毒上清并過(guò)濾，以M O I 3 ：1 比例感染第三代M S C s和2 9 3 T 細(xì)胞，2 4 小時(shí)重復(fù)感染一次，4 8 小時(shí)后用F I X 促凝活性一期法測(cè)定細(xì)胞上清中c F I X 活性。結(jié)果：成功構(gòu)建含c F I X 基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒P T K l 6 4 。P T K l 6 4 與△N R F 、V S V - G 構(gòu)成三質(zhì)粒慢病毒載體，同時(shí)以攜帶綠色熒光蛋白G F P 的載體P T K l 5 3 為對(duì)照，共

4、轉(zhuǎn)染2 9 3 T 包裝細(xì)胞7 2 小時(shí)后可在熒光顯微鏡下觀察到對(duì)照組G F P 表達(dá)率約為7 0 ％，病毒滴度約5 x 1 0 6 I U ／m l 。以培養(yǎng)第三代的M S C s ( C D 9 0 表達(dá)陽(yáng)性率為9 4 ．3 1 ％) 和2 9 3 T 細(xì)胞作為靶細(xì)胞，過(guò)濾后的病毒上清感染靶細(xì)胞，4 8 小時(shí)后培養(yǎng)細(xì)胞上清可檢測(cè)到c F I X 活性，兩種靶細(xì)胞分別為( 2 6 ．3 3 士2 ．0 8 ) ％和( 1 9 ．7 土