慢病毒介導血友病B基因在離體細胞中的表達.pdf

1、徐州醫(yī)學院碩士學位論文慢病毒介導血友病B基因在離體細胞中的表達姓名：閆冬梅申請學位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學（血液病）指導教師：徐開林;潘秀英20060501徐州醫(yī)學院碩士學位論文慢病毒介導血友病B 基因在離體細胞中的表達中文摘要目的：構建泛醌啟動子( P U B ) 驅(qū)動的攜帶狗凝血因子I X ( c F I X ) 基因的慢病毒三質(zhì)粒表達載體，體外轉染骨髓基質(zhì)細胞( M S C s ) 和人胚腎細胞( 2 9 3 T ) ，觀察轉染后是

2、否能獲得有效的c F I X 表達，為臨床基因治療血友病B 提供實驗依據(jù)。方法：采用限制性內(nèi)切酶酶切載體P T K 6 8 ’，獲得c F I X 基因片斷，并連接至慢病毒載體P T K l 5 1 ( 含P U B 啟動子) ，重組質(zhì)粒命名為P T K l 6 4 。采用改良的磷酸鈣沉淀法將包裝質(zhì)?！鱊 R f 、包膜蛋白質(zhì)粒V S V - G 和構建的重組轉移質(zhì)粒P T K l 6 4 共轉染2 9 3 T 包裝細胞，7 2 小時后

3、收集病毒上清并過濾，以M O I 3 ：1 比例感染第三代M S C s和2 9 3 T 細胞，2 4 小時重復感染一次，4 8 小時后用F I X 促凝活性一期法測定細胞上清中c F I X 活性。結果：成功構建含c F I X 基因的慢病毒載體轉移質(zhì)粒P T K l 6 4 。P T K l 6 4 與△N R F 、V S V - G 構成三質(zhì)粒慢病毒載體，同時以攜帶綠色熒光蛋白G F P 的載體P T K l 5 3 為對照，共

4、轉染2 9 3 T 包裝細胞7 2 小時后可在熒光顯微鏡下觀察到對照組G F P 表達率約為7 0 ％，病毒滴度約5 x 1 0 6 I U ／m l 。以培養(yǎng)第三代的M S C s ( C D 9 0 表達陽性率為9 4 ．3 1 ％) 和2 9 3 T 細胞作為靶細胞，過濾后的病毒上清感染靶細胞，4 8 小時后培養(yǎng)細胞上清可檢測到c F I X 活性，兩種靶細胞分別為( 2 6 ．3 3 士2 ．0 8 ) ％和( 1 9 ．7 土