中國血友病A患者基因突變譜的研究.pdf

1、血友病A是一種常見的X染色體連鎖隱性遺傳性出血性疾病，發(fā)病率為1/5000。血友病A的臨床癥狀與其體內(nèi)殘余的凝血因子Ⅷ促凝活性有關，重型血友病A(FⅧ:C<1％)發(fā)生自發(fā)性出血或者外傷后的出血頻率明顯高于輕中型，因而關節(jié)畸形等致殘性并發(fā)癥的發(fā)生率高于輕中型患者?；颊呒膊〉膰乐爻潭扰cFⅧ基因突變類型有直接的關系，造成FⅧ結構重大缺失的突變往往導致重型的血友病A，而引起蛋白中某位點氨基酸改變的突變，其后果與該氨基酸所處的位點有關，其可能致病

2、機制包括影響FⅧ與其他蛋白作用位點，影響其分泌及穩(wěn)定性.血友病A患者的主要治療手段為FⅧ制劑的替代治療，包括血漿來源的濃縮FⅧ或者基因重組的FⅧ，后者的優(yōu)勢在于可以避免血制品相關的感染如HIV、HBV及HCV等。替代治療的普及使血友病A患者的生活質(zhì)量得到極大的提高。但是在替代治療過程中最嚴重的并發(fā)癥是FⅧ同種抗體的產(chǎn)生，尤其在重型血友病中，發(fā)生率可達30％，抑制物的出現(xiàn)可以直接中和外源性FⅧ的止血效果。對于中國血友病患者的基因突變譜的組

3、成，以往研究的較少，而基因突變類型對于血友病A患者家系可能需要的遺傳咨詢、抑制物產(chǎn)生的風險估計及對FⅧ基因結構及功能影響的理解具有重要的地位。
　　 第二部分
　　 目的：研究中國血友病A患者基因突變譜的組成及FⅧ抗體的發(fā)生率。以探討血友病A患者發(fā)病的分子機制，并了解FⅧ抗體高危的基因突變類型.為血友病A的遺傳咨詢提供所需要的資料。
　　 方法：對145例血友病A患者進行突變檢測及FⅧ抗體的檢測。通過LD-PCR

4、法檢測內(nèi)含子22倒位，通過雙管多重PCR技術檢測內(nèi)含子1倒位.對上述2種倒位陰性的患者通過PCR擴增FⅧ基因主要編碼區(qū)、側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)、啟動子區(qū)及下游非翻譯區(qū)，通過直接測序探查突變。發(fā)現(xiàn)突變的標本通過比對正反雙向測序結果確認。應用一期法測定患者的FⅧ:C，應用Bethesda法測定患者FⅧ抗體是否存在及滴度。結果:共有145名血友病A患者參與該項研究，其中重型患者107名(74％)，中型患者35例(24％)，輕型患者3例(2％)。內(nèi)含子2

5、2倒位及內(nèi)含子2倒位陽性患者分別為57例和3例，均為重型血友病A患者，在重型血友病A中的發(fā)生率分別為53.2％及2.8％，占血友病A患者總數(shù)的39％及2％。內(nèi)含子倒位陰性的85名患者中，共發(fā)現(xiàn)64種突變，其中33種突變是首次報道的(無義突變6種，插入突變3種，缺失突變8種，剪接位點突變2種，錯義突變14種)。無義突變及插入/缺失突變的病人以重型血友病A為主(78％，21/27)。錯義突變以輕中型為主(66％，23/35)。共有2人發(fā)現(xiàn)F

6、Ⅷ抗體，均為重型患者，致病的FⅧ基因缺陷均為內(nèi)含子22倒位。
　　 結論：
　　 1.我們在該研究中共發(fā)現(xiàn)了33種新的FⅧ基因突變，其中無義突變6種，插入突變3種，小片段缺失突變8種，剪接位點突變2種，錯義突變14種。充分體現(xiàn)了血友病A發(fā)病機制中FⅧ基因突變的異質(zhì)性。
　　 2.內(nèi)含子22及內(nèi)含子2倒位在本研究重型臥病人中的發(fā)生率分別為53.2％及2.8％，作為FⅧ基因突變中僅有的2個可以直接檢測的重復性突變，對

7、于HA患者的遺傳咨詢具有重要的意義。
　　 3.與其他3種哺乳動物同源序列相比對，新發(fā)現(xiàn)的14種錯義突變均位于保守位點。提示原有氨基酸對FⅧ結構和功能的重要性。
　　 4.我們的研究中FⅧ抑制物發(fā)生率明顯低于其他研究。造成此結果可能的原因是該研究樣本量較少，無法真實反映抑制物的實際發(fā)生率。種族因素及其他相對低風險因素(第一次替代治療年齡，替代治療強度及密度)在其中的作用也有待于進一步的研究。
　　 第二部分

8、>　　 目的：對一個遺傳性無纖維蛋白原血癥家系進行凝血及基因分析，以了解遺傳性無纖維蛋白原血癥的發(fā)病機制。
　　 方法：我們采集了該家系三代共6人的外周血，應用全自動血凝儀檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)及纖維蛋白原(FG，Clauss法)，并應用免疫比濁法測定纖維蛋白原抗原。以PromegaDNA提取試劑盒提取先證者及其他家族成員DNA，利用PCR擴增先證者FGA、FGB及FGG

9、基因編碼區(qū)、側(cè)翼序列及啟動子區(qū)。PCR擴增產(chǎn)物純化后通過直接DNA測序方法檢測基因突變。發(fā)現(xiàn)突變后對其他家系成員相同位點進行擴增測序，以確定是否有相同的基因突變。
　　 結果：先證者的父母為三代近親。先證者FGA基因發(fā)現(xiàn)純合突變c.934_935insA，造成蛋白序列改變p.Ser312fsX42。先證者父母、奶奶、姥姥及姑姑均為該突變的雜合子。該突變?yōu)閲H上首次報道。結論FGAc.934_935insA純合突變導致的FGA移碼