血友病乙患者的基因分析及發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分，47例血友病乙患者的基因分析及發(fā)病機(jī)制研究
　　研究目的：
　　血友病乙（Hemophilia B,HB）為X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病，其發(fā)病機(jī)制多為F9基因突變致凝血因子IX缺乏或結(jié)構(gòu)功能的異常，導(dǎo)致血友病乙的發(fā)生。凝血因子IX（Factor IX）在內(nèi)源性凝血途徑中發(fā)揮著重要作用，活化的凝血因子IX在凝血因子VIII、鈣離子及磷脂的共同作用下可將FactorX激活，啟動(dòng)共同凝血途徑，發(fā)揮止凝血作用。血友

2、病乙患者的主要臨床表現(xiàn)是自幼反復(fù)發(fā)生的異常出血，大多數(shù)患者因皮膚或關(guān)節(jié)的反復(fù)出血而就診。目前國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的血友病乙患者均能找到相應(yīng)的分子缺陷，以錯(cuò)義突變?yōu)橹?，其中點(diǎn)突變占60～80%左右。為了確診血友病乙患者的分子缺陷及尋找F9基因突變的規(guī)律，為遺傳學(xué)咨詢(xún)奠定基礎(chǔ)，我們對(duì)47例明確診斷的血友病乙的男性患者進(jìn)行基因測(cè)序和分析以求解決此問(wèn)題。
　　研究方法：
　　3年來(lái)我們收集血友病乙男性患者47例，均根據(jù)臨床表現(xiàn)、血漿凝血因子

3、IX活性檢測(cè)及家族史等資料確診。常規(guī)方法收集患者及親屬血樣，分離血細(xì)胞和血漿，提取DNA,多聚酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增結(jié)合直接測(cè)序法分析先證者的F9基因的所有外顯子及其側(cè)翼序列，并將測(cè)序結(jié)果和國(guó)際F9基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)突變后排除多態(tài)性。
　　結(jié)果：
　　對(duì)47例 HB患者進(jìn)行基因分析共發(fā)現(xiàn)40種基因突變，突變類(lèi)型包括插入框移突變2種，無(wú)義突變6種，剪切位點(diǎn)的突變2種，錯(cuò)義突變30種。其中33種突變?yōu)橐褕?bào)道的突變類(lèi)型，

4、7種突變國(guó)際上未見(jiàn)報(bào)道。40種突變中發(fā)生在信號(hào)肽序列的有3種，前肽及γ-羧基化結(jié)構(gòu)域的有7種突變，表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域有7種，活化肽區(qū)域有5種，絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域有18種突變。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)基因分析，直接闡述了血友病乙患者發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制，對(duì)進(jìn)行進(jìn)一步的功能方面的研究提供了基礎(chǔ)。47例HB患者的基因分析表明F9基因突變具有明顯的異質(zhì)性，且錯(cuò)義突變?nèi)允悄壳癋9基因的主要突變方式，與重型HB有更密切的聯(lián)系。F9基因突

5、變所常見(jiàn)的外顯子部位與他們編碼的氨基酸蛋白行使功能時(shí)所起的作用有關(guān)。直接進(jìn)行基因測(cè)序?qū)ρ巡∫业臄y帶者診斷及產(chǎn)前診斷提供了一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法。
　　第二部分，一例女性血友病乙患者發(fā)病機(jī)制的研究
　　研究目的：
　　血友病乙（Hemophilia B, HB）是凝血因子IX（factor IX, FIX）基因突變引起血漿FIX量的缺乏或質(zhì)的缺陷所導(dǎo)致的一種 X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，男性通常有臨床出血的癥狀表現(xiàn)，

6、而女性為攜帶者，無(wú)明顯的出血癥狀。女性血友病乙患者罕見(jiàn)，目前國(guó)外報(bào)道有幾例女性患者。本研究對(duì)一例女性患者及其家系的其他成員進(jìn)行了表型及基因分析，了解基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系，了解FIX蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，研究基因突變對(duì)FIX蛋白表達(dá)量及功能的影響，旨在從分子水平闡明該例女性患者的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　1.采集該例女性HB患者及家系成員的外周靜脈血，檢測(cè)血漿中部分活化凝血活酶時(shí)間(Activated Partial Thr

7、ombinoplstin Time, APTT)、血漿凝血酶原時(shí)間(Prothrobin Time, PT)、血漿凝血酶時(shí)間(Thrombin Time, TT)、血漿纖維蛋白原(Fibrinogen, FIB)、FVIII:C及FIX:C活性。
　　2.提取外周血基因組 DNA，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增患者F9基因的8個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析尋找突變位點(diǎn)，并排除突變位點(diǎn)的多態(tài)性。
　　3.采用基于PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)

8、建攜帶特定突變位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒。
　　4. Western blotting方法分析患者外周血漿中FIX蛋白的含量。
　　5.以野生型質(zhì)粒為對(duì)照，在HEK293細(xì)胞中表達(dá)突變型質(zhì)粒，分別測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液及裂解液中的FIX蛋白含量。
　　結(jié)果：
　　1.該例女性患者及其妹妹、母親、女兒及外甥女的APTT及FIX:C分別有不同程度的延長(zhǎng)和降低，其姑姑的APTT及 FIX:C均為正常，所有家族成員 PT檢測(cè)及FVII

9、I:C均在正常范圍。
　　2.通過(guò)基因測(cè)序分析，在該例女性患者及妹妹的 FIX基因中均發(fā)現(xiàn)了30992G>C(Ala291Pro)純合突變，其母親、女兒和外甥女均發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的雜和突變，其姑姑的F9基因中未發(fā)現(xiàn)基因突變。通過(guò)特異性限制性?xún)?nèi)切酶BsmI排除了基因的多態(tài)性。
　　3.與正常人血漿中的FIX蛋白含量相比，患者外周血漿中檢到痕量的FIX蛋白。
　　4.體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，與轉(zhuǎn)染野生型 F9WT細(xì)胞表達(dá)上清及中的 F

10、IX蛋白比
　　較，F(xiàn)9MT(G30992C)表達(dá)上清中未檢測(cè)到FIX蛋白的表達(dá)。與轉(zhuǎn)染野生型F9WT細(xì)胞裂解液中的FIX蛋白比較，F(xiàn)9MT(G30992C)無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1. F9基因純合突變（G30992C）是導(dǎo)致該例女性患者發(fā)生的分子病理機(jī)制。
　　2. G30992C突變未影響FIX蛋白的表達(dá)，但明顯影響FIX蛋白的分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)，可能是通過(guò)改變FIX蛋白的空間構(gòu)象，導(dǎo)致其不能有效的分泌至胞外