四種新的基因突變導(dǎo)致血友病B分子發(fā)病機(jī)制研究及通讀療法對無義突變所致血友病治療的初步研究.pdf

1、第一部分:四種新的基因突變導(dǎo)致血友病B分子發(fā)病機(jī)制研究
　　 目的：
　　 1.本研究采用PCR技術(shù)及DNA直接測序法對11例山西籍漢族無關(guān)血友病B(hemophiliaB，HB)家系先證者的凝血因子Ⅸ(factorⅨ，F(xiàn)Ⅸ)基因進(jìn)行了全部外顯子及其側(cè)翼序列的檢測，以篩選HB患者FⅨ基因缺陷類型并討其分子發(fā)病機(jī)制；
　　 2．構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl/FⅨwt，為實時觀察FⅨ真核表達(dá)載體在H

2、EK293細(xì)胞中的表達(dá)及FⅨ基因突變導(dǎo)致HB的分子發(fā)病機(jī)制的研究奠定實驗基礎(chǔ)；
　　 3．對三種新的FⅨ基因突變R116Stop(CGA→TGA)合并點突變A-38G(GCA→GGA)，C51G(TGT→GGT)，6479insertC進(jìn)行研究，探討基因型與表型的相關(guān)性。研究三種基因突變對FⅨ表達(dá)量及功能的影響，旨在從分子水平闡明HB的發(fā)病機(jī)制；
　　 4．對一種新的FIX基因小片段插入突變：FIX基因17784位插入1

3、03bp的插入突變進(jìn)行研究，探討基因型與表型的相關(guān)性。研究該基因突變對FⅨ表達(dá)量及功能的影響，旨在從分子水平闡明HB的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：
　　 1．采集11例HB患者及家系成員的靜脈抗凝血，提取基因組DNA;PCR方法對FIX基因8個外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物膠回收后采用雙脫氧鏈終止法在ABI3730測序儀上對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序；
　　 2．用Chromas軟件將測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對，

4、尋找基因突變。對異常測序結(jié)果進(jìn)行反向測序及重復(fù)測序以證實基因突變；對于檢測到的錯義突變，對100例正常對照相應(yīng)區(qū)域的PCR擴(kuò)增及序列測定進(jìn)行基因多態(tài)性的排除分析；
　　 3．以pcDNA/FⅨwt質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出目的基因FⅨ的開放閱讀框(openreadingframe，ORF)區(qū)，對pIRES2-ZsGreenl進(jìn)行EcoR1和BamH1雙酶切，使用Infusion酶對線性pIRES2-ZsGreen1雙酶切產(chǎn)物及FⅨORF

5、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后篩選陽性克??；對陽性克隆進(jìn)行DNA測序及凝膠電泳鑒定；
　　 4．針對FIX基因17784位插入103bp的插入突變，采用微衛(wèi)星位點檢測HB先證者及家系成員FⅨ基因5號外顯子區(qū)域；
　　 5．采用基于PCR的定點突變技術(shù)構(gòu)建攜帶相應(yīng)突變位點的突變型真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl/FⅨ；定點突變產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后篩選陽性克??；對陽性克隆進(jìn)行DNA測序及凝膠電泳鑒定；
　　

6、 6．應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將野生型、突變型FⅨ表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，使用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率；
　　 7．采用實時定量PCR檢測不同位點突變對FⅨ基因mRNA表達(dá)水平的影響；
　　 8．采用ELISA方法檢測野生型及各突變型FⅨ基因蛋白的表達(dá)量水平；
　　 9．采用一期法檢測野生型及各突變型FIX基因蛋白的表達(dá)活性水平；
　　 10.采用細(xì)胞免疫熒光法檢測野生型及各突變型FⅨ基因蛋白的表達(dá)水

7、平。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過對11例HB先證者FIX基因8個外顯子及其側(cè)翼序列的直接測序檢測發(fā)現(xiàn)了11種基因突變，在11種突變類型中有8種為外顯子區(qū)域的點突變，其中包括有1例為無義突變R116Stop(CGA→TGA)合并錯義突變A-38G(GCA→GGA)，其余7例錯義突變分別為V181A(GTT→GCT),C336R(TGT→CGT),C5IG(TGT→GGT),R-4Q(CGG→CAG),A-2ID(GCT→

8、GAT)，F(xiàn)32S(TTT→TCT)，C361R(TGT→CGT);1例為側(cè)翼序列的剪切位點點突變G20566A(G→A)，1例為插入單個堿基突變：6479insertC，1例為小片段插入突變：17784位插入103bp的插入突變；
　　 2．經(jīng)查詢國際HB突變數(shù)據(jù)庫及有關(guān)文獻(xiàn)，證實其中有4種為首次發(fā)現(xiàn)：R116Stop(CGA→TGA)合并錯義突變A-38G(GCA→GGA)，C51G(TGT→GGT)，6479insertC

9、，F(xiàn)Ⅸ基因17784位插入103bp的插入突變?yōu)閲H未報道的基因突變。100例健康成人對照樣本FⅨ外顯子及其側(cè)翼序列直接基因測序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)上述突變，表明上述突變不是FⅨ基因多態(tài)性；
　　 3.成功構(gòu)建pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt．為構(gòu)建FⅨ突變體并研究HB分子發(fā)病機(jī)制及實時監(jiān)測FⅨ的轉(zhuǎn)染效率奠定實驗基礎(chǔ)；
　　 4．針對FⅨ基因17784位插入103bp的插入突變，微衛(wèi)星位點檢測HB先證者及家系成員結(jié)果，先證

10、者1和2微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果可見130、180、233、283bp四個片段。先證者的外祖母、母親、姨母微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果可見130、180、233、283bp四個片段，表明該插入突變遺傳自母系。先證者2的父親為正常序列，沒有出現(xiàn)233、283bp片段。先證者1的130bp的曲線下面積／233bp的曲線下面積比值為1.69，先證者2的130bp的曲線下面積／233bp的曲線下面積比值為0.29，顯示先證者1相比先證者2的130bp片段比例高

11、，驗證了先證者1出血癥狀較先證者2輕的臨床表現(xiàn)；
　　 5．成功構(gòu)建R116Stop(CGA→TGA)合并點突變A-38G(GCA→GGA)，C5IG(TGT→GGT)，6479insertC，F(xiàn)Ⅸ基因17784位插入103bp的插入突變對應(yīng)的pIRES2-ZsGreenl/FⅨ突變體；
　　 6．R116Stop合并A-38G突變的載體在HEK-293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后，實時定量檢測結(jié)果顯示FIXmRNA表達(dá)量較野生型明顯下

12、降(p＜0.05)，一期法及ELISA法檢測細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)上清液FⅨ：C及FⅨ：Ag較野生型明顯下降(p＜0.05)，激光共聚焦顯微鏡觀察FⅨ表達(dá)量較野生型明顯降低(p＜0.05)；
　　 7.C51G突變的載體在HEK-293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后，實時定量檢測結(jié)果顯示FⅨmRNA表達(dá)量較野生型明顯下降(p＜0.05)，一期法及ELISA法檢測細(xì)胞裂解液FⅨ．C及FⅨ：Ag較野生型無明顯區(qū)別(p＞0.05)，而細(xì)胞培養(yǎng)上清液FⅨ：

13、C及FⅨ：Ag較野生型明顯下降(p<0.05)，激光共聚焦顯微鏡觀察FⅨ表達(dá)量較野生型無明顯降低(p＞0.05)；
　　 8.6479InsertC突變的載體在HEK-293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后，實時定量檢測結(jié)果顯示FⅨmRNA表達(dá)量較野生型明顯下降(p＜0.05)，一期法及ELISA法檢測細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)上清液FⅨ：C及FⅨ：Ag較野生型明顯下降(p＜0.05)，激光共聚焦顯微鏡觀察FⅨ表達(dá)量較野生型明顯降低(p＜0.05)；

14、r>　　 9.FⅨ基因17784位插入103bp突變的載體在HEK-293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后，實時定量檢測結(jié)果顯示FⅨmRNA表達(dá)量較野生型無明顯下降(p＞0.05)，一期法及ELISA法檢測細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)上清液FⅨ：C及FⅨ：Ag較野生型明顯下降(p＜0.05)，激光共聚焦顯微鏡觀察FⅨ表達(dá)量較野生型明顯降低(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 l.FⅨ基因缺陷是HB的分子發(fā)病機(jī)制，其基因缺陷具有明顯異質(zhì)性，各外顯

15、子及其側(cè)翼序列均存存基因突變，其中最常見的為外顯子區(qū)域的錯義突變；DNA直接測序法是診斷HB及明確其分子發(fā)病機(jī)制最直接、最精確的方法之一；
　　 2．R116Stop合并A-38G突變使FⅨ基因EGF-2區(qū)產(chǎn)生截短型蛋白，使其蛋白質(zhì)活性、含量及表達(dá)量降低，影響其蛋白質(zhì)功能，導(dǎo)致了HB的發(fā)生，其突變遺傳自母系；同時提示在HB患者基因缺陷檢測過程中應(yīng)檢測FⅨ所有外顯子及其側(cè)翼序列；
　　 3．C5IG突變導(dǎo)致FⅨ基因EGF-

16、1區(qū)第1個二硫鍵不能正確形成，從而影響了蛋白質(zhì)的正確折疊和構(gòu)象形成，導(dǎo)致EGF-1區(qū)與EGF-2區(qū)之問不能正確形成蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)，其所產(chǎn)生的突變蛋白質(zhì)受細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量調(diào)控體系的調(diào)節(jié)而可能存在分泌障礙和細(xì)胞內(nèi)滯留并降解，導(dǎo)致了HB的發(fā)生，其為自發(fā)突變；
　　 4.6479insertC突變，位于2號外顯子的GLA區(qū)，引起讀碼框的改變，導(dǎo)致其編碼的FⅨ蛋白在36位氨基酸出現(xiàn)終止密碼,36位氨基酸為12個Υ-羧基谷氨酸殘基之一，形成截短型

17、蛋白，使GLA區(qū)結(jié)構(gòu)失去完整性，影響FIXa與FⅧa結(jié)合，導(dǎo)致HB的發(fā)生，其突變遺傳自母系；
　　 5．FⅨ基因17784位插入103bp突變考慮為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在FⅨ基因17784位插入了87個核苷酸的5SrRNA序列，并在其前后正向重復(fù)了16個核苷酸序列。插入突變位于FⅨ123位氨基酸后，可能是引起讀碼框移碼，在136位氨基酸處形成截短型蛋白，也可能在翻譯過程中切除插入序列時出現(xiàn)錯誤導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯錯誤。同時其不同先證者之間正常

18、序列及異常序列比例不同，導(dǎo)致了不同的臨床表現(xiàn)，其基因突變源自于母系遺傳。
　　 第二部分:通讀療法對無義突變所致血友病治療的初步研究
　　 目的：
　　 1．構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreen1/FⅧwt，為能夠?qū)崟r觀察FⅧ真核表達(dá)載體在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，并為FⅧ基因突變導(dǎo)致HA的分子發(fā)病機(jī)制的研究奠定實驗基礎(chǔ)；
　　 2．分別在FⅧ、FⅨ基因的5’端、3’端及中間序列中選擇發(fā)生頻率高的

19、無義突變位點(FⅧ：W14X,R1696X,K1827X,R2307X;FⅨ：R29X,R116X,W194X,R333X)作為研究重點，構(gòu)建相應(yīng)的上述FⅧ、FⅨ無義突變體，為后續(xù)觀察PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素對重型血友病無義突變的體外促通讀作用奠定試驗基礎(chǔ)；
　　 3．進(jìn)行不同濃度氨基糖苷類藥物慶大霉素及非氨基糖苷類小分子化合物(PTC124)藥物干預(yù)，檢測藥物干預(yù)前后無義突變體FⅧ/FⅨ的mRNA、蛋白表達(dá)量及活性

20、變化，為重型血友病無義突變的體外促通讀作用提供實驗數(shù)據(jù)。
　　 方法：
　　 1．以pc1/FⅧwt質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出目的基因FⅧ的ORF區(qū)，對pIRES2-ZsGreenl進(jìn)行EcoRI和BamH1雙酶切，使用Infusion酶對線性pIRES2-ZsGreen1雙酶切產(chǎn)物及FⅧORF增產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后篩選陽性克??；對陽性克隆進(jìn)行DNA測序及凝膠電泳鑒定：
　　 2．采用基于PCR的定點突變技術(shù)

21、構(gòu)建攜帶相應(yīng)突變位點的突變型真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreen1/FⅧ；定點突變產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后篩選陽性克??；對陽性克隆進(jìn)行DNA測序及凝膠電泳鑒定；
　　 3．采用CCK-8(CellCountingkit-8)法檢測PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素對HEK-293細(xì)胞的作用48h后增殖和毒性分析，確定PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素對重型血友病無義突變的體外促通讀作用的藥物濃度；
　　 4．應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將

22、野生型、突變型FⅧ、FⅨ表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，使用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，并給與不同濃度氨基糖苷類藥物慶大霉素及PTC124藥物干預(yù)48h;
　　 5．采用實時定量PCR檢測無義突變型FⅧ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素干預(yù)前后mRNA表達(dá)：
　　 6．采用ELISA方法檢測無義突變型FⅧ、FIX在PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素干預(yù)前后FⅧ、FⅨ基因蛋白的表達(dá)量水平；
　　

23、7．采用一期法檢測無義突變型FⅦ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素干預(yù)前后FⅧ、FⅨ基因蛋白的表達(dá)活性水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功構(gòu)建pIRES2-ZsGreen1/FⅧwt，為構(gòu)建FⅧ突變體并研究HA分子發(fā)病機(jī)制及實時監(jiān)測FⅧ的轉(zhuǎn)染效率奠定實驗基礎(chǔ)：
　　 2．成功構(gòu)建FⅦ：WI4X，R1696X，K1827X，R2307X;FⅨ：R29X，R116X，W194X，R333X相應(yīng)的上述FⅧ、F

24、Ⅸ無義突變體，為后續(xù)觀察PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素對重型血友病無義突變的體外促通讀作用奠定試驗基礎(chǔ)；
　　 3．采用CCK-8法檢測PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素對HEK-293細(xì)胞的作用48h后增殖和毒性分析，其IC50(halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance)值，分另n為慶大霉素：4.23±0.32mM，PTC124:111.585±9.597μM。結(jié)合文

25、獻(xiàn)報道，據(jù)此各選取5個藥物濃度進(jìn)行PTC124（藥物濃度為l0μM，20μM,40μM，60μM，80μM）及氨基糖苷類藥物慶大霉素（藥物濃度為0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM）對重型血友病無義突變的體外促通讀作用研究；
　　 4．FⅨ:R29Ⅹ，R116X．W194X，R333X中：W194X，R333X無義突變并不影響FⅨ基因表達(dá)量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)；R29X，R116X在藥物促通讀

26、作用后，F(xiàn)Ⅸ基因表達(dá)量有不同程度增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。FⅧ：W14X，R1696X，K1827X，R2307X中：R1696X無義突變并不影響FⅧ基因表達(dá)量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，W14X，K1827X，R2307X在藥物促通讀作用后，F(xiàn)Ⅷ基因表達(dá)量有不同程度增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；
　　 5．野生型及各突變組分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，一期法進(jìn)行FⅨ：C、FⅧ：C測定。分別以

27、野生型質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、pIRES2-ZsGreenl／FⅧwt轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中的FⅨ：C、FⅧ：C為100％，促通讀藥物作用結(jié)果與末給約組相比較。結(jié)果表明，F(xiàn)Ⅸ：R29X，W194X，R116X，R333X在慶大霉素2.5mM和PTC-12480}IM作用后，F(xiàn)IX:C與未給藥組相比較增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。FⅧ：W14X，R1696X，K1827X，R2307X在慶大霉素2.5mM和PT

28、C-12480μM作用后，F(xiàn)Ⅷ：C與未給藥組相比較增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；
　　 6．野生型及各突變組分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，ELISA法檢測FⅨ：Ag、FⅧ：Ag測定，分別以野生型質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、pIRES2-ZsGreen1/FⅧwt轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中的FⅨ：Ag、FⅧ：Ag為100％，促通讀藥物作用結(jié)果與未給藥組相比較。結(jié)果表明，F(xiàn)Ⅸ：R29X，R116X，R333X在慶

29、大霉素2.5mM和PTC-12480VM作用后，F(xiàn)Ⅸ：Ag與未給藥組相比較增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；W194X在藥物作用后，F(xiàn)Ⅸ:Ag與未給藥組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。FⅧ：W14X，R1696X，K1827X在慶大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后，F(xiàn)Ⅷ：Ag與未給藥組相比較增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；R2307X在藥物作用后，F(xiàn)Ⅷ:Ag與未給藥組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.

30、05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．無義突變主要使FⅧ、FⅨ基因的翻譯過程提前終止，產(chǎn)牛截短型凝血因子蛋白；同時凝血因子PTC-mRNA穩(wěn)定性降低，通過NMD途徑使其降解，致使凝血因子含量減低，從而導(dǎo)致血友病發(fā)生；
　　 2．PTC124及氨基糖苷類藥物慶大霉素對HEK-293細(xì)胞的毒性結(jié)果提示PTC124的I毒性大于慶大霉素，考慮可能PTC124的溶解介質(zhì)為二甲基亞砜，其細(xì)胞毒性所致;
　　 3．PTC1

31、24和慶大霉素均能夠起到促通讀作用使得無義突變的mRNA表達(dá)量較未給藥組有不同程度的增加；同時使得無義突變體的凝血因子蛋白表達(dá)量較未給藥組有不同程度的增加：其促通讀作用均呈一定的劑量依賴性；
　　 4．PTC124和慶大霉素在血友病無義突變的促通讀作用中具有相似的通讀效率。
　　 第三部分:免疫相關(guān)指標(biāo)檢測在原發(fā)免疫性血小板減少癥的診斷及治療中的意義
　　 目的：
　　 1．檢測原發(fā)免疫性血小板減少癥(p

32、rimaryimmunethrombocytopenia，ITP)患者及非免疫性血小板減少癥患者分泌GPⅡb/Ⅲa(glycoproteinⅡb/Ⅲa)抗體B細(xì)胞、血小板特異性抗體(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ)的變化，評價其對診斷ITP及非免疫性血小板減少癥的作用及臨床意義：
　　 2．檢測ITP患者T淋巴細(xì)胞亞群的變化，以探討細(xì)胞免疫因素在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用及其臨床意義；
　　 3．對ITP患者進(jìn)行血小板生成素(

33、thrombopoietin，TPO)含量及網(wǎng)織血小板百分率(thepercentageofreticulatedplatelet，Rp％)變化的檢測，同時分析二者與血小板的相關(guān)性，討論其在ITP診斷和發(fā)病中的意義。
　　 方法：
　　 1．應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(Enzyme-LinkedImmunospotAssay，ELISPOT)、改良血小板抗原單克隆抗體固相化檢測技術(shù)(modifiedMonocfonalanti

34、bodyimmunobifizationofpiateIetantigensassay,MAIPA)分別檢測64例ITP患者、33例非免疫性血小板減少癥患者及31例正常對照者分泌GPⅡb/Ⅲa抗體B細(xì)胞頻數(shù)、血小板特異性抗體（抗GPⅡb/Ⅲa抗體、抗GPⅠb/Ⅸ抗體）表達(dá)的變化，并比較檢測結(jié)果；
　　 2．應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測64例ITP患者及31例正常對照者T淋巴細(xì)胞亞群的比值并比較檢測結(jié)果；
　　 3．應(yīng)用夾心酶聯(lián)免疫

35、吸附法、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測64例ITP患者和3l例正常對照血小板生成素(TPO)含量及網(wǎng)織血小板百分率(RP％)，同時檢測其血小板計數(shù)(platelet，PLT)及骨髓巨核細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1．新診斷的ITP患者及持續(xù)性和慢性ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗體B細(xì)胞頻數(shù)(7.6±4.6/105個PBMC,5.3±3.0/105個PBMC)明顯高于非免疫性皿小板減少癥患者(2.2±2.0/105個PBMC，P＜0

36、.05)及正常對照組（1.3±0.5/105個PBMC，P＜0.05），同時新診斷的ITP組患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗體B細(xì)胞頻數(shù)高于持續(xù)性和慢性ITP組患者(P＜0.05)，而非免疫性血小板減少癥患者及正常對照組間的差異無顯著性(P>0.05)。新診斷的lTP患者及持續(xù)性和慢性ITP組患者血小板特異性抗體（抗GPⅡb/Ⅲa抗體、抗GPⅠb/Ⅸ抗體）的OD值(0.51±0.11、0.49±0.10;0.48±0.06、0.46±0.09、

37、)高于非免疫性血小板減少癥患者(0.37±0.07、0.39±0.11，P＜0.05)及正常對照組(0.33±0.06、0.41±0.03，P＜0.05)，而非免疫性血小板減少癥患者及正常對照組間的差異無顯著性(P＞0.05)。通過ELISPOT法檢測分泌GPllb/llla抗體B細(xì)胞對ITP診斷的敏感性為68.75％，特異性為90.91％，高于改良MAIPA法的敏感性（X2=6.25，P＜0.05）。根據(jù)ROC曲線，ELISPOT區(qū)分

38、ITP患者和非免疫性血小板減少患者的鑒別效度為0.885;
　　 2.ITP組CD3+T淋巴細(xì)胞百分比(60.88±14.59)、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比(28.41±10.55)及CD4+/CD8+的比值(1.18±0.59)均明顯低于正常對照組(69.89±6.43、35.38±5.05、1.64±0.29)(P＜0.05)，CD8+T淋巴細(xì)胞(27.09±9.86)則顯著高于正常對照(22.08±4.54)(P＜0.05)

39、；
　　 3．ITP患者巨核細(xì)胞增多組和正常對照組TPO水平明顯低于ITP患者巨核細(xì)胞正常組差異有顯著性(P＜0.05)，而二者之間差異無顯著性(P>0.05)。ITP組RP比值明顯高于對照組差異有顯著性(P＜0.05)。經(jīng)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ITP組患者Rp％及TPO與血小板數(shù)目呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1．應(yīng)用ELISPOT方法檢測ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗體B細(xì)胞相比MAIPA法檢測ITP患者血小板特異

40、性抗體具有更高敏感性及特異性，可提高ITP的實驗室診斷水平，對指導(dǎo)臨床治療有一定的臨床意義；
　　 2．應(yīng)用ELISPOT方法檢測ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗體B細(xì)胞對區(qū)分新診斷的及持續(xù)性和慢性ITP具有一定意義；
　　 3．T淋巴細(xì)胞亞群比例失衡和功能的紊亂參與了ITP的發(fā)病過程：調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的失衡是治療的一個新方向；
　　 4．TPO檢測對探討血小板生成的機(jī)制及輔助ITP的診斷有一定意義，可根據(jù)TPO