慢病毒載體介導(dǎo)的外源基因在HEK-293T細(xì)胞中的高效穩(wěn)定表達(dá).pdf

1、基因工程(gene engineering)誕生于20世紀(jì)70年代，是指在體外將不同來源的基因分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，然后將其導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞內(nèi)，從而使得外源基因在其中“安家落戶”并能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖，以及在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)和產(chǎn)生人類所需要的蛋白質(zhì)。
　　利用基因工程表達(dá)功能蛋白和一些具有重要研究價值的蛋白是基因工程的重要內(nèi)容，目前利用基因工程表達(dá)外源蛋白的研究已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在衛(wèi)生保健、

2、科學(xué)研究和工業(yè)等各個不同的領(lǐng)域。外源蛋白的主要表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。每種表達(dá)系統(tǒng)有其各自的優(yōu)點(diǎn)，同時在重組蛋白生產(chǎn)的種類、數(shù)量以及操作的簡易性和生產(chǎn)成本等方面也有各自的制約。
　　大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最古老的、應(yīng)用最廣泛的一種原核表達(dá)系統(tǒng)。它的優(yōu)點(diǎn)是人們對它的背景研究最透徹、操作方便、生產(chǎn)成本低和重組蛋白產(chǎn)量高。但它也有明顯的缺點(diǎn)，例如缺乏真核系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄及翻譯后的表達(dá)修飾加

3、工功能，所生產(chǎn)的蛋白活性差，常以不溶性的包涵體形式表達(dá)，且其細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。
　　酵母表達(dá)系統(tǒng)不僅具有原核表達(dá)系統(tǒng)生長迅速和表達(dá)量高的特點(diǎn)，同時還有蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾等的功能。其缺點(diǎn)是在表達(dá)外源基因時常常會造成產(chǎn)物蛋白的不均一、降解和信號肽加工不完全等問題。且它只具有真核生物表達(dá)系統(tǒng)的部分加工修飾功能，無法加工修飾結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源蛋白。
　　昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由于其表達(dá)量高且具有比較完善的蛋白翻譯后加T

4、修飾功能，正被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜生物蛋白的生產(chǎn)。但其糖基化的寡糖鏈與哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)有所差別，不能正確的修飾加工復(fù)雜哺乳動物蛋白的N-糖基化，且操作繁瑣、培養(yǎng)成本較高。
　　相反的，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)則很好地克服了上述各載體的缺點(diǎn)，具有非常完善的糖基化修飾功能和折疊機(jī)制，可以理想地對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后加工、修飾并分泌到細(xì)胞外，相對于原核、酶母及昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白活性更接近于天然蛋白，更適合于各種生物

5、蛋白的表達(dá)。因此，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有望成為理想的真核生物蛋白表達(dá)系統(tǒng)，盡管其也存在一些缺點(diǎn)，如蛋白表達(dá)量低、基因表達(dá)調(diào)控復(fù)雜、花費(fèi)時間長且成本更高等。
　　外源蛋白的有效表達(dá)需要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，同時必須考慮蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、技術(shù)條件、實(shí)驗(yàn)要求等因素。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然表達(dá)量低，但因其能正確表達(dá)出活性接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源蛋白，因此成為目前蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)發(fā)展的主流方向。而哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白的一個

6、關(guān)鍵步驟就是獲得一個能穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因的克隆。目前將外源基因?qū)爰?xì)胞主要有兩種方法，一種就是利用化學(xué)方法（比如脂質(zhì)體、磷酸鈣、PEI等）或物理方法（例如顯微注射、電穿孔等）通過瞬時轉(zhuǎn)染直接將DNA導(dǎo)入細(xì)胞;另一種就是利用病毒載體感染介導(dǎo)外源基因進(jìn)入細(xì)胞，如慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等。瞬時轉(zhuǎn)染方法通常表達(dá)效率低、成本高且整合基因不穩(wěn)定，外源基因有可能隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時限短暫。而病毒載體如慢病毒載體介導(dǎo)

7、的感染通常表達(dá)效率高且外源基因能與細(xì)胞基因組發(fā)生重組，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白的持久、穩(wěn)定表達(dá)。
　　慢病毒載體(Lentiviral vector, LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一種亞型，是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改建而來的病毒載體系統(tǒng)，能高效地將目的基因?qū)雱游锘蛉说脑?xì)胞或細(xì)胞系中。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，能在反轉(zhuǎn)錄酶及整合酶的作用下將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA并整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成m

8、RNA，回到細(xì)胞漿中，翻譯目的蛋白。慢病毒載體能有效感染并整合到分裂及非分裂細(xì)胞中，包括腦細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。
　　目前，病毒載體已成為動物體內(nèi)及體外表達(dá)外源基因的有力工具，慢病毒載體在人類細(xì)胞系中已經(jīng)被成功應(yīng)用于生產(chǎn)百毫克級別的有活性的外源蛋白。而要利用慢病毒載體在HEK293T細(xì)胞中高效穩(wěn)定

9、表達(dá)外源活性蛋白并以此為工具探索重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)，建立快速生產(chǎn)平臺，我們需要選擇一個合適的慢病毒載體，然后利用這個載體攜帶外源基因在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá)，并檢測其表達(dá)水平及穩(wěn)定性。
　　本文分為兩部分：
　　第一部分：通過比較包含不同表達(dá)元件的慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白GFP在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)水平及穩(wěn)定性，篩選一個合適的慢病毒載體。
　　第二部分：通過將丙型肝炎病毒(HCV)E1基因克隆到慢病毒表達(dá)

10、載體中，并包裝成慢病毒感染HEK-293T細(xì)胞后篩選單克隆細(xì)胞系，并檢測E1蛋白表達(dá)水平及穩(wěn)定性來檢驗(yàn)這個慢病毒載體表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜蛋白的能力，探索重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)，建立快速生產(chǎn)平臺。
　　首先我們將包含不同表達(dá)元件的5個慢病毒表達(dá)載體，分別是包含HS4絕緣子和EF1α啟動子的pFIN-EF1α-GFP-2A-mCherH-WPRE，包含UCOE元件和SFFV啟動子的p'HR.cppt.3'1.2kb-UCOE-SFFV-eGFP，包

11、含CMV啟動子和β-globin內(nèi)含子的pTYF-CMV(β-globin intron)-eGFP和分別只包含CMV啟動子或EF1α啟動子的pTYF-CMV-eGFP和pTYF-EF1α-eGFP，與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞包裝病毒并檢測病毒滴度，按MOI=1000感染293T細(xì)胞后每隔3-5天按1傳10的比例連續(xù)傳代，并利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果

12、顯示慢病毒包裝成功，滴度分別為2.8×108、3.7×108、2.5×108、1.0×109、2.5×108病毒基因組/毫升(vg/ml)。病毒感染細(xì)胞3天后，在熒光顯微鏡下都能觀察到感染細(xì)胞發(fā)出熒光，且經(jīng)傳3到5代后細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平達(dá)到高峰并持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)5周以上。感染細(xì)胞經(jīng)傳代9周后，細(xì)胞狀態(tài)仍然良好，感染細(xì)胞的活細(xì)胞率都大于80％。感染5周后細(xì)胞熒光率分別為22.7±3.3％、5.8±0.4％、54.1±3.7％、57.6±7.8

13、％和38.7±1.1％;而平均熒光強(qiáng)度分別為6391.7±1030.4、1436.0±1.4、21845.7±1959.0、26596.7±3900和9467.7±134.8。9周后，細(xì)胞熒光率分別為27.6±6.9％、5.9±0.2％、76.5±2.0％、91.7±1.7％和38.2±3.9％;平均熒光強(qiáng)度分別為1985.7±67.4、386.5±5.0、12814.7±1703.6、21192±882.7和1664.7±113.4。

14、
　　上述結(jié)果顯示單獨(dú)含CMV啟動子或包含CMV啟動子和β-globin內(nèi)含子的慢病毒載體介導(dǎo)的GFP在293T細(xì)胞中的表達(dá)效率最高。含HS4絕緣子和EF1a啟動子的載體介導(dǎo)的蛋白表達(dá)效率并沒有比單獨(dú)含EF1a啟動子的載體介導(dǎo)的表達(dá)效率高;含UCOE元件和SFFV啟動子的載體介導(dǎo)的蛋白表達(dá)水平明顯比其他載體介導(dǎo)的表達(dá)水平要低，這提示我們包含CMV啟動子的載體可以做為一個理想的慢病毒載體在HEK293T細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)外源活性蛋白

15、。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證含CMV啟動子的慢病毒在表達(dá)外源結(jié)構(gòu)復(fù)雜蛋白的能力，我們將HCV E1基因克隆到慢病毒載體pTYF-CMV-eGFP中得到表達(dá)載體pTYF-CMV-E1。經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染初步鑒定E1的表達(dá)后，將表達(dá)載體與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞包裝成慢病毒載體，取一定量的LV-E1感染HEK-293T細(xì)胞，后用有限稀釋法篩選高效表達(dá)E1蛋白的單克隆細(xì)胞并進(jìn)行消化傳代，通過Western Blot方法檢測單克隆細(xì)

16、胞系中E1蛋白的表達(dá)情況。
　　通過上述方法，我們成功構(gòu)建了含E1基因的慢病毒表達(dá)載體pTYF-CMV-E1，并通過瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞初步鑒定E1蛋白的表達(dá)，目的蛋白能正常表達(dá)并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中。我們成功包裝慢病毒載體LV-E1，并將一定量的病毒感染HEK-293T細(xì)胞后，通過感染細(xì)胞上清Western Blot鑒定表明重組慢病毒載體成功感染了HEK-293T細(xì)胞。后用有限稀釋法篩選得到能高效表達(dá)E1蛋白的單克隆細(xì)胞