外源CpTI基因在轉(zhuǎn)基因蘋果中的表達(dá)及特性.pdf

1、蘋果是世界上最重要的果樹樹種之一。蘋果轉(zhuǎn)基因研究開始于1989年，隨后相繼有蘋果砧木、品種基因轉(zhuǎn)化成功報(bào)道，但研究多集中于基因轉(zhuǎn)化，關(guān)于外源基因在轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)、特性以及外源基因在轉(zhuǎn)化系中的遺傳規(guī)律等研究尚少，開展此方面研究將加速轉(zhuǎn)基因蘋果在生產(chǎn)中的應(yīng)用和推廣。 本試驗(yàn)以轉(zhuǎn)豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)基因蘋果(Malus domestica Borkh．)(包括皇家嘎拉、王林

2、、喬納金和紅富士60個(gè)株系)為試材，應(yīng)用PCR、RT-PCR、熒光原位雜交、室內(nèi)蟲試等方法，研究了外源CpTI基因在蘋果轉(zhuǎn)化組培苗中DNA、RNA和蛋白等水平的表達(dá)：應(yīng)用轉(zhuǎn)基因花粉培養(yǎng)、果實(shí)蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳等方法，研究了轉(zhuǎn)基因蘋果花粉和果實(shí)的特性；通過(guò)雜交授粉試驗(yàn)，研究了外源基因在轉(zhuǎn)基因蘋果中的遺傳規(guī)律：通過(guò)試管微嫁接方法，研究了標(biāo)記基因在蘋果砧穗間的傳導(dǎo)性。主要研究結(jié)果如下： 1.在60個(gè)常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的轉(zhuǎn)CpTI基因

3、蘋果轉(zhuǎn)化株系中均可檢測(cè)出CpTI特異基因片斷：除2個(gè)轉(zhuǎn)化株系在50 mg/L卡那霉素濃度下出現(xiàn)花葉現(xiàn)象，表現(xiàn)缺乏卡那霉素抗性外，其他株系在含相同濃度卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常。 2.通過(guò)對(duì)FISH的相關(guān)技術(shù)參數(shù)研究，初步建立了節(jié)果染色體制備和熒光原位雜交技術(shù)體系。以CpTI基因片斷為探針，利用該體系在蘋果細(xì)胞核上成功檢出了熒光雜交信號(hào)，表明外源基因整合到了轉(zhuǎn)基因蘋果的基因組中。 3.部分轉(zhuǎn)CpTI基因蘋果株系有較強(qiáng)的殺蟲

4、和抑蟲作用。60個(gè)轉(zhuǎn)化株系中有2個(gè)株系蟲試校正死亡率為100％；28個(gè)株系校正死亡率為正值，其中11個(gè)株系校正死亡率大于等于50％，經(jīng)秩合檢驗(yàn)分析，有4個(gè)轉(zhuǎn)化株系的蟲重與對(duì)照蟲重相比差異顯著，表明其有明顯抑制幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的作用。 4.喂食轉(zhuǎn)CpTI基因蘋果組培苗葉片的棉蛉蟲體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活性變化結(jié)果表明：不同轉(zhuǎn)基因株系對(duì)蟲體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用存在差異，分別表現(xiàn)為抑制能力較強(qiáng)、較弱或沒(méi)有抑制能力。其中有9個(gè)株系能顯

5、著抑制棉蛉蟲幼蟲體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活力，表明這些株系具有較好的抑制幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的作用。 5.對(duì)60個(gè)轉(zhuǎn)化株系蘋果組培苗進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入的外源CpTI基因在43個(gè)株系中得到了較高水平的表達(dá)，在17個(gè)株系中表達(dá)強(qiáng)度低。外源基因在轉(zhuǎn)化株系(嘎拉32)中高效表達(dá)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，片斷回收，克隆，測(cè)序，外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中核苷酸表達(dá)與Phaseolus vulgaris trypsin proteinase inh

6、ibitor gene和Tieganqing trypsin inhibitor(TI)gene有100％同源性，蛋白表達(dá)與proteinase inhibitor-cowpea有100％同源性。 6.優(yōu)化的適宜蘋果葉片蛋白質(zhì)毛細(xì)管電泳程序?yàn)椋翰捎酶牧急恋矸ㄌ崛〉鞍踪|(zhì)，電泳過(guò)程中溫度為25℃，電壓為20 kV，0.5 psi進(jìn)樣5 s，電泳時(shí)間為17 min，檢測(cè)波長(zhǎng)在280 nm處的蛋白質(zhì)區(qū)帶。電泳結(jié)果表明：與對(duì)照相比有4

7、個(gè)嘎拉轉(zhuǎn)化株系在第7.65 min分別出現(xiàn)一條特異吸收峰帶。 7.轉(zhuǎn)基因蘋果花粉離體萌發(fā)率(24.47％)低于對(duì)照(62.05％)，但轉(zhuǎn)基因花粉對(duì)卡那霉素的抗性高于對(duì)照。掃描電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入對(duì)蘋果花粉粒形態(tài)、大小、紋飾等方面產(chǎn)生明顯的影響。 8.轉(zhuǎn)基因嘎拉大部分果實(shí)中可以檢測(cè)到nptⅡ酶活性，但不同果實(shí)中的nptⅡ酶活性強(qiáng)度有差異，其中nptⅡ酶活性較強(qiáng)的占71.43％，較弱的占21.43％，檢測(cè)不到的占7.

8、14％；果實(shí)蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因節(jié)果嘎拉果實(shí)中蛋白種類少于對(duì)照。 9.以嘎拉轉(zhuǎn)化株系與未轉(zhuǎn)化富士蘋果進(jìn)行雜交，對(duì)果實(shí)種胚培養(yǎng)并利用卡那霉素抗性和PCR檢測(cè)外源基因存在狀況，結(jié)果表明雜交實(shí)生后代外源基因分離比例1：1，符合由一對(duì)顯性基因控制的遺傳性狀的自由分離規(guī)律，表明外源基因?yàn)橐伙@性基因，呈單點(diǎn)顯性遺傳。 10.轉(zhuǎn)基因組培苗微嫁接接穗以選用繼代培養(yǎng)30 d左右，帶有2～4片葉片的新梢為宜；適當(dāng)提高BA濃