蚓激酶基因在山羊乳腺中的表達及轉基因小鼠的制備.pdf

1、蚓激酶(Lumbrokinase)是從蚯蚓中提取的具有纖溶和溶栓活性的多酶組分。1991年由Mihara等首次分離并命名。目前已有多種蚓激酶制劑，其商品名為普恩復、百奧、博洛克及溶栓膠囊等，主要用于缺血性腦病、冠心病和心肌梗死等心腦血管疾病的治療。最近Fan等發(fā)現(xiàn)蚓激酶的一種組分(EFE-Ⅲ-1)可透過小腸上皮吸收并在循環(huán)系統(tǒng)中保持其生物學活性，表明蚓激酶具有進一步研究和開發(fā)的價值。到目前為止，雖然蚓激酶基因已被克隆，但并沒有表達出具有

2、活性的蚓激酶蛋白的報道。實現(xiàn)蚓激酶的表達進而通過制備乳腺生物反應器大量獲得表達產(chǎn)物，對于蚓激酶的研究及產(chǎn)品的開發(fā)有重要意義。 動物乳腺生物反應器(Mammaryglandbioreactor)技術屬于轉基因動物技術具體應用的一個方面，是指利用哺乳動物乳腺特異性表達的啟動子元件構建轉基因動物，指導外源基因在轉基因動物的乳腺中表達，并從動物的乳汁中獲取重組蛋白。1987年，Gordon等首先從轉基因小鼠的乳汁中獲得了人類tPA蛋白。

3、此后的研究證實，動物乳腺具有廣泛表達外源基因的能力，一些在臨床上有重要應用的蛋白類藥物如α-1-抗胰蛋白酶、tPA、乳轉鐵蛋白及蛋白C等相繼在動物乳腺中得以表達，其中一些表達產(chǎn)物已進入了臨床應用。制備乳腺生物反應器的方法與制備轉基因動物的技術一致，有顯微注射技術、精子載體技術、逆轉錄病毒感染技術及體細胞核移植等。其中主要使用的是顯微注射技術。顯微注射技術存在著成本高、周期長、轉基因效率低及目的基因隨機整合等不足。體細胞核移植方法雖然代表

4、了制備乳腺生物反應器的趨勢，但對實驗條件及實驗室整體研究水平的要求較高，很多實驗室不具備這樣的條件。目前已有利用逆轉錄病毒感染制備乳腺生物反應器的方法，此方法對實驗條件的要求相對較低，同時實驗成本不高，有可能成為一種較為實用的方法。本實驗對逆轉錄病毒感染的方法進行了嘗試，在目的基因的選擇上使用人工合成的蚓激酶基因。前期實驗已證實蚓激酶基因可以在山羊乳腺中暫時表達，這在一定程度上可以反映目的基因在轉基因動物乳腺中的表達情況。本實驗期望通過

5、制備重組逆轉錄病毒并利用重組病毒感染乳腺細胞的方法實現(xiàn)蚓激酶基因在山羊乳腺的表達。 為了減少培育轉基因大家畜的盲目性，在建立大家畜乳腺生物反應器之前，都要對所用目的基因的表達性能進行鑒定。目前，鑒定和篩選乳腺表達載體的方法主要有三種：乳腺細胞表達法、動物乳腺暫時表達法及制備轉基因小鼠乳腺生物反應器模型。乳腺細胞表達法雖然簡便、客觀，但不能完全反映動物在生理條件下的真實情況。動物乳腺暫時表達法操作簡便，能部分反映動物在生理條件下的

6、表達情況，但仍存在表達時間短、表達量與注射劑量有關等不足，通常用于對所構建的乳腺表達載體的表達效率進行初步的評估。制備轉基因小鼠雖然周期較長且成本較高，有時也不能完全反映制備的轉基因大家畜的表達情況，但由于小鼠的繁殖周期短，產(chǎn)仔率高，可在整體水平上研究目的基因的表達情況，因此制備轉基因小鼠仍是評估乳腺表達載體所普遍采用的方法。本實驗在實現(xiàn)了蚓激酶基因暫時表達的基礎上，采用常規(guī)的顯微注射技術制備蚓激酶轉基因小鼠，為下一步制備蚓激酶轉基因大

7、家畜的工作打下了基礎。 材料和方法1.1實驗動物純種波爾山羊及昆明種小白鼠。 1.2菌株、質粒和細胞株E.coliDH5α為本室保存。哺乳動物表達載體pcDNA3，Invitrogen公司。載體pGEMT-bCP，含有山羊β-酪蛋白基因啟動子；載體pMD18T-LK，含有人工合成的蚓激酶基因cDNA；逆轉錄病毒載體pLNC-LacZ，均為前期工作所構建并保存。PA317和NIH3T3細胞株購自中國科學院上海細胞研究所。

8、 1.3蚓激酶基因在山羊乳腺的暫時表達1.3.1構建包含山羊β-酪蛋白基因啟動子及人工合成蚓激酶基因cDNA的乳腺表達載體并使用堿裂解法大量制備。 1.3.2通過直接注射將載體DNA導入泌乳期山羊乳腺。 1.3.3使用纖維蛋白平板法檢測乳汁中蚓激酶表達產(chǎn)物的活性。 1.4重組逆轉錄病毒載體介導的蚓激酶基因在山羊乳腺的表達1.4.1構建包含山羊β-酪蛋白基因啟動子及人工合成蚓激酶基因cDNA的重組逆轉錄病毒載

9、體。 1.4.2利用PA317細胞包裝所構建的重組逆轉錄病毒載體。 1.4.3使用PCR技術鑒定克隆細胞株中目的基因的整合。 1.4.4在NIH3T3細胞上測定重組逆轉錄病毒的滴度。 1.4.5通過直接注射將重組逆轉錄病毒導入臨產(chǎn)前山羊乳腺。 1.4.6使用纖維蛋白平板法檢測乳汁中蚓激酶表達產(chǎn)物的活性。 1.5蚓激酶轉基因小鼠的制備 1.5.1制備顯微注射用DNA。 1.5

10、.2利用常規(guī)顯微注射技術制備蚓激酶轉基因小鼠。 1.5.3通過PCR及Southern雜交鑒定蚓激酶轉基因鼠及其后代。 1.5.4使用纖維蛋白平板法檢測轉基因鼠乳汁中蚓激酶表達產(chǎn)物的活性。 結果2.1蚓激酶基因在山羊乳腺的暫時表達結果構建了包含山羊β-酪蛋白基因啟動子和蚓激酶基因cDNA的乳腺表達載體pBLK。通過直接注射將其導人山羊的乳腺組織并檢測乳汁中蚓激酶表達產(chǎn)物的活性。結果顯示蚓激酶基因可以在山羊乳腺中暫

11、時表達。注射后6-9h的表達量最高，達到2.0×105U/L，并持續(xù)表達至60h。重復注射對表達結果無影響。 2.2重組逆轉錄病毒載體介導的蚓激酶基因在山羊乳腺的表達結果構建了包含山羊β-酪蛋白基因啟動子及人工合成蚓激酶基因cDNA的重組逆轉錄病毒載體pLNBLK。通過脂質體介導的方法將其轉染逆轉錄病毒包裝細胞PA317，經(jīng)G418加壓篩選，獲得產(chǎn)毒細胞克隆。PCR鑒定證實目的基因已整合入產(chǎn)毒細胞基因組。在NIH3T3細胞上測定

12、的重組病毒滴度為2×104～1×105CFU/ml。將產(chǎn)毒細胞上清直接注入臨產(chǎn)前山羊的乳腺組織，待產(chǎn)羔后采集乳汁并測定蚓激酶表達產(chǎn)物的活性，結果表明乳汁中有蚓激酶的表達，且產(chǎn)羔后第45日，乳汁中表達產(chǎn)物的纖溶活性無明顯下降。 2.3蚓激酶轉基因小鼠的制備結果使用SalⅠ和PvuⅡ酶切乳腺表達載體pBLK，得到含有全部表達盒的DNA片段，采用常規(guī)顯微注射技術將其導入小鼠受精卵的雄原核。共注射800枚卵，將注射后存活的約500枚卵移

13、植到29只假孕母鼠輸卵管內，其中11只母鼠懷孕，產(chǎn)仔43只。經(jīng)PCR及Southern雜交鑒定，3只為轉基因小鼠。將存活的2只轉基因小鼠與正常小鼠交配，所生仔鼠中均檢測出轉基因后代，表明轉入的目的基因能正常傳代。使用纖維蛋白平板法檢測轉基因鼠乳汁中目的基因的表達情況，未測定出蚓激酶的活性。 結論3.1構建了蚓激酶乳腺表達載體，通過直接注射將載體導入泌乳期山羊乳腺，實現(xiàn)了蚓激酶基因在山羊乳腺的暫時表達。 3.2構建了蚓激酶