人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達載體的構(gòu)建及在山羊乳腺上皮細胞系中的表達.pdf

1、人乳鐵蛋白(hLTF)，也稱人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織、細胞內(nèi)，在調(diào)節(jié)機體免疫和機體內(nèi)鐵的平衡、促進細胞生長等方面具有重要作用。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白(rhLTF)的研究對人類健康有很重要的現(xiàn)實意義，具有廣闊的市場前景和重要的理論價值。 轉(zhuǎn)基因克隆動物是指將轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)與克隆動物技術(shù)相結(jié)合，以動物體細胞(包括動物成體體細胞、胎兒成纖維細胞等)為受體，將目的基因以DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進行

2、傳代培養(yǎng)的動物體細胞，再以這些體細胞為核供體，進行動物的克隆。 本買驗以此理論為基礎(chǔ)，從乳腺特異性表達載體的構(gòu)建、奶山羊乳腺上皮細胞(GMECs)系的建立、外源基因轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞、轉(zhuǎn)染細胞株的建立等幾個方面進行研究，建立了乳腺特異性表達轉(zhuǎn)基因體細胞系，為下一步的轉(zhuǎn)基因克隆動物的制備奠定了基礎(chǔ)。1人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達載體的構(gòu)建 本買驗利用實驗室已有的人乳鐵蛋白cDNA(2320bp)、牛a-S1

3、酪蛋白(asl-casein)5’端(6.3Kb)和3’端(1.5Kb)表達調(diào)控序列、Neo(700bp)、增強子、P01vA序列，構(gòu)建了人乳鐵蛋白乳腺特異性表達載體afLF。人乳鐵蛋白cDNA為從正常婦女乳腺細胞cDNA厙中，利用高保真Taq酶PCR法擴增出，含信號肽序列和3，終止信號。牛a-S1酪蛋白系用PCR方法從?；蚪MDNA中擴增出5’調(diào)控區(qū)(2.3Kb)和3’調(diào)控區(qū)(1.5Kb)，然后在5’端上游增加長約為4Kb牛酪蛋白基因

4、的基因組DNA調(diào)控序列。增強子為本實驗室以相應(yīng)的質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得，含有ATG和Kozak保守序列。Neo基因來自本實驗室保存質(zhì)粒。2外源基因片段轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細胞及陽性細胞株的建立 山羊乳腺上皮細胞，采用乳腺組織塊膠原酶消化法，DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得混雜的原代乳腺細胞，通過胰蛋白酶分步消化，經(jīng)2-3代純化，獲得較純化的山 羊乳腺上皮細胞。 通過電轉(zhuǎn)染法將含有抗性基因Neo<

5、'r>的afLF基因片段導(dǎo)入到體外培養(yǎng)4.5代的山羊乳腺上皮細胞(GMECs)，經(jīng)含400μg／ml G418的篩選培養(yǎng)液篩選三周后，得到有抗性的細胞株26株，克隆環(huán)挑取單克隆株并進行擴大培養(yǎng)。提取上述細胞DNA進行PCR檢測，有14株細胞成功轉(zhuǎn)染了外源基因。對轉(zhuǎn)染有外源基因的細胞株進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)ELISA檢測，共有2株細胞能穩(wěn)定表達人乳鐵蛋白。 結(jié)果表明，我們所構(gòu)建的乳腺特異性表達載體轉(zhuǎn)染GMECs，能夠表達相應(yīng)的重