基于Cre-LoxP系統(tǒng)的皮膚特異性表達(dá)Tβ4基因載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系篩選.pdf

1、毛發(fā)是皮膚的附屬物，哺乳動(dòng)物毛發(fā)的生長(zhǎng)要經(jīng)歷毛囊的發(fā)育和分化過(guò)程，這一調(diào)控過(guò)程涉及到許多的功能基因和生長(zhǎng)因子的參與。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源功能基因通過(guò)核移植的方式轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，使其在皮膚特異性表達(dá)，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已獲得成功。人們?cè)诶棉D(zhuǎn)基因產(chǎn)品獲得利益的同時(shí)，也必須重視轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問(wèn)題，要解決這一問(wèn)題，如何刪除標(biāo)記基因是關(guān)鍵。本研究依據(jù)Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的特異性敲除功能，將已經(jīng)構(gòu)建好的皮膚特異性表達(dá)

2、Tβ4基因的載體中的標(biāo)記基因，進(jìn)行選擇性的刪除，增加其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。同時(shí)為轉(zhuǎn)基因絨山羊提供核供體。
　　首先構(gòu)建中間表達(dá)載體pMD19T-K14-Tβ4-PolyA，再進(jìn)一步引入Cre/LoxP基因敲除系統(tǒng)，采用PCR技術(shù)，以pDsRed2-1載體為模板，人工克隆CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建皮膚特異性表達(dá)胸腺素β4的條件打靶載體pKT-L（功能元件順序K14-Tβ4-PolyA-LoxP-CDsRed-LoxP），采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法

3、分別轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒及皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)紅色熒光的細(xì)胞匯合度超過(guò)50％后，加入適量的G418篩選，經(jīng)過(guò)一周后，即可獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。PCR法驗(yàn)證細(xì)胞基因組中外源基因是否整合，采用半定量RT-PCR法檢測(cè)Tβ4 mRNA在兩種細(xì)胞中的豐度，Western blot分別檢測(cè)這兩種細(xì)胞基因組中Tβ4蛋白的表達(dá)水平。
　　測(cè)序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了皮膚特異性表達(dá)Tβ4基因的條件打靶載

4、體pKT-L，且載體的各元件:角蛋白14啟動(dòng)子，Tβ4基因，PolyA，CMV啟動(dòng)子，LoxP序列和紅色熒光蛋白均按正確的順序連接。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)基因組中外源Tβ4基因已成功整合。 RT-PCR半定量實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)Tβ4基因的細(xì)胞基因組中Tβ4mRNA的表達(dá)顯著增加，Western blot表明轉(zhuǎn)Tβ4基因后細(xì)胞中蛋白的表達(dá)量也大大增加，且Tβ4 mRNA水平在皮膚成纖維細(xì)胞比在胎兒成纖維細(xì)胞中表達(dá)量更高，表明K14皮膚特異性啟動(dòng)