八聚體蛛絲蛋白基因毛囊特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、蜘蛛絲具有質(zhì)量輕、強(qiáng)度高及韌性大等優(yōu)越特性，由于其開發(fā)利用難度大，因此借助生物工程技術(shù)生產(chǎn)蛛絲原材料成為首選方法。八聚體蛛絲蛋白基因是由人工合成的擬蜘蛛拖絲蛋白基因的核心序列S連接成的八聚體(Spidroinl8，8S)，為了進(jìn)一步探究8S基因的功能及特性，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了毛囊細(xì)胞中特異性表達(dá)8S基因的載體，并轉(zhuǎn)染了小鼠表皮細(xì)胞和絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，驗(yàn)證了啟動(dòng)子的表達(dá)能力;通過轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞獲得陽性克隆，為嵌合體小鼠的制備奠定基礎(chǔ)，并

2、運(yùn)用原核注射方法，制備了8S轉(zhuǎn)基因小鼠，為研究8S對毛發(fā)特性的影響提供了研究基礎(chǔ)。
　　1.8S基因毛囊特異性表達(dá)載體pCDsR-K8SP的構(gòu)建
　　通過PCR擴(kuò)增出PolyA片段，連接到載體pMD19T-8S上構(gòu)成中間克隆載體pMD19T-8S-PolyA。分別用KpnⅠ和SalⅠ將其與帶有毛囊特異性啟動(dòng)子的載體pCDsR-KAP6-1-IGFⅠ雙酶切后，重組成8S基因的毛囊特異性表達(dá)載體pCDsR-K8SP，經(jīng)酶切鑒定與

3、測序分析，結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)相符。
　　2.8S基因毛囊特異性表達(dá)載體pCDsR-K8SP的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及鑒定
　　在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下，將毛囊特異性表達(dá)載體pCDsR-K8SP分別轉(zhuǎn)染入小鼠表皮細(xì)胞和絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，經(jīng)雙重篩選獲得陽性克隆。對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增檢測，結(jié)果表明外源目的基因8S已穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中。提取篩選得到的轉(zhuǎn)基因小鼠表皮細(xì)胞及絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測，結(jié)

4、果表明外源基因8S在這兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中均呈現(xiàn)表達(dá)陽性。
　　3.8S轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞的獲得及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　通過轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞，獲得了外源基因8S已穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中的陽性克隆，為下一步制備嵌合體小鼠奠定基礎(chǔ)。同時(shí)使用載體pCDsR-KSSP對小鼠受精卵進(jìn)行原核注射，獲得67只待檢原代小鼠，經(jīng)PCR鑒定，共檢測出6只8S轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，陽性得率為8.96％。本實(shí)驗(yàn)中8S轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及初步鑒定，為進(jìn)