幾種皮膚特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞鑒定.pdf

1、羊絨的生長(zhǎng)十分復(fù)雜，受到環(huán)境和遺傳因素的共同影響，與毛囊的分化、形成、毛囊周期密切相關(guān)，這一過(guò)程受到一些抑制絨毛生長(zhǎng)基因如FGF5，F(xiàn)GF18等的調(diào)控，同時(shí)也受到一些促絨毛生長(zhǎng)基因如EGF，VEGF等的調(diào)控。在絨山羊育種領(lǐng)域，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源促絨毛生長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)入絨山羊體內(nèi)或者敲除抑制絨毛生長(zhǎng)的特定基因，成為提高絨毛產(chǎn)量研究的熱點(diǎn)。
　　本研究包括兩部分的內(nèi)容，一是構(gòu)建皮膚特異性表達(dá)Cre重組酶基因載體，以應(yīng)用于將來(lái)?xiàng)l件性敲除抑制

2、絨毛生長(zhǎng)的基因;二是構(gòu)建含有多克隆位點(diǎn)的皮膚特異性表達(dá)功能基因的通用載體，為下一步構(gòu)建皮膚特異性表達(dá)促絨毛生長(zhǎng)基因的載體提供條件。實(shí)驗(yàn)首先采用PCR技術(shù)克隆皮膚特異性表達(dá)的人表皮角蛋白5啟動(dòng)子(Hum keratin5 promoter，K5)和角蛋白14啟動(dòng)子(Hum keratin14promoter, K14)及Cre重組酶基因，之后以pIRES2-EGFP-KAP6載體為基本骨架，通過(guò)重組連接，構(gòu)建了pIRES2-EGFP-KA

3、P6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等3種皮膚特異性表達(dá)的載體;同時(shí)構(gòu)建了含CMV啟動(dòng)子的pIRES2-EGFP-Cre非特異性表達(dá)載體;將pIRES2-EGFP-KAP6-Cre和pIRES2-EGFP-Cre兩種載體以LipofectamineTM2000介導(dǎo)，分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系并應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)外源基因的表達(dá)。
　　結(jié)果表明

4、，pIRES2-EGFP-KAP6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等皮膚特異性表達(dá)載體和含CMV啟動(dòng)子的pIRES2-EGFP-Cre非特異性載體構(gòu)建成功，載體測(cè)序正確，各元件按正確的順序連接。pIRES2-EGFP-KAP6-Cre，pIRES2-EGFP-Cre載體轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，PCR結(jié)果顯示外源基因整合到了細(xì)胞基因組中。半定量RT-PCR檢測(cè)pIRES2-E