13934.嗜熱菌β糖苷酶基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定

1、分類號(hào)Q812學(xué)校代碼10129UDC57.08學(xué)號(hào)2010211011嗜熱菌β糖苷酶基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定StudyonConstructionTransfectionofMammaryGlSpecificExpressionVectfSsβgly申請(qǐng)人：杜威學(xué)科門類：理學(xué)學(xué)科專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)研究方向：動(dòng)物遺傳與發(fā)育指導(dǎo)教師：周歡敏教授論文提交日期：二〇一三年六月摘要利用牛乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)生乳糖分解酶從而生產(chǎn)低乳糖牛

2、奶，是解決乳糖不耐癥的一種手段，而構(gòu)建高效、特異的表達(dá)載體是制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)將來源于古細(xì)菌的嗜熱菌β糖苷酶基因（LacS）根據(jù)牛的密碼子使用頻率進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并合成了優(yōu)化后的基因。以牛乳球蛋白（BLG）上游調(diào)控區(qū)域做為啟動(dòng)子，以嗜熱菌β糖苷酶（LacS）為目的基因，添加了Loxp錨定的新霉素抗性基因（Neo）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EGFP)，構(gòu)建了pLOXEGFPBLGLacS載體。并且通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法

3、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠的乳腺癌細(xì)胞，并篩選得到單克隆。陽性單克隆通過PCR進(jìn)行DNA水平的整合檢測(cè)；經(jīng)催乳素誘導(dǎo)后的陽性單克隆通過RTPCR進(jìn)行mRNA水平表達(dá)檢測(cè)。研究結(jié)果如下：首先乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出924bp牛β乳球蛋白（BLG）基因5調(diào)控序列，并與T載體連接記為pMD19BLG，質(zhì)粒大小為3.7kb。然后將其與公司優(yōu)化合成的pUC57LacS質(zhì)粒，pLOXEGFP質(zhì)粒通過相應(yīng)的酶切后進(jìn)行連接，經(jīng)基因重組后構(gòu)建

4、了乳腺特異性表達(dá)載體pLOXEGFPBLGLacS。使牛β乳球蛋白基因5端調(diào)控序列啟動(dòng)嗜熱菌糖苷酶基因在乳腺中特異表達(dá)，而新霉素抗性基因和EGFP的表達(dá)，便于篩選陽性克隆。其次，乳腺特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞。37℃水浴解凍小鼠乳腺癌細(xì)胞，并進(jìn)行G418最小致死濃度測(cè)定然后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)重構(gòu)載體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞，并通過PCR和RTPCR的方法進(jìn)行重構(gòu)載體的整合檢測(cè)和表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果表明，小鼠乳腺癌細(xì)胞G418最小致死濃度為700μ