嗜熱菌糖苷酶基因牛乳腺特異表達載體的構(gòu)建及脂質(zhì)體介導其轉(zhuǎn)染細胞的研究.pdf

1、利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)有經(jīng)濟價值的生物活性蛋白已成為當前生物領(lǐng)域研究的熱點，制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是構(gòu)建高效、特異的表達載體，而β-乳球蛋白(BLG)是反芻動物乳中主要的乳清蛋白。本研究以牛β-乳球蛋白基因上游調(diào)控成分作為啟動子，嗜熱菌糖苷酶基因lacS為目的基因，構(gòu)建了lacS基因乳腺特異表達載體，并通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細胞(bFF)，借助新霉素抗性基因(Neo)和增強型綠色熒光蛋白報告基因(EGFP)來篩

2、選、純化陽性克隆細胞，為利用核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動物提供細胞來源。研究結(jié)果如下： 首先，通過PCR技術(shù)擴增出0.92kb牛β-乳球蛋白基因5'端調(diào)控序列和1.49kb嗜熱菌糖苷酶基因編碼序列。并將上述序列與pIRES2-EGFP載體及pUC19載體經(jīng)基因重組構(gòu)建了乳腺特異表達載體pBLI。使牛β-乳球蛋白基因5'端調(diào)控序列啟動嗜熱菌糖苷酶基因在乳腺中特異表達，而新霉素抗性基因和增強型綠色熒光蛋白基因作為標記基因在人巨細胞病毒啟動

3、子指導下非組織特異性表達。 其次，應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法從妊娠2～3月的牛胎兒耳部皮膚中分離純化成纖維細胞。對培養(yǎng)的細胞進行形態(tài)學觀察、生長曲線測定、S4基因性別檢測和G418敏感濃度的測定。結(jié)果表明，培養(yǎng)的細胞具有正常形態(tài)和生長特性，其供體牛為雌性，G418篩選濃度為800μg/ml，維持濃度為300μg/ml。 最后，以線性化的乳腺特異表達載體pBLI為外源基因，采用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細胞。通過比較不同DNA劑量