產α-半乳糖苷酶乳酸菌的篩選和特性研究及α-半乳糖苷酶基因agaI的克隆和表達.pdf

1、α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，α-D-galactoside galactohydrolase；EC3.2.1.22）也稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶在醫(yī)療、食品、化工及飼料等方面都有著廣泛的應用前景。在飼料工業(yè)中，α-半乳糖苷酶添加劑是去除豆粕中α-半乳糖苷寡糖類抗營養(yǎng)因子的首選方法，但是目前飼用α-半乳糖苷酶的生產目前尚未形成產業(yè)化，其中，性質優(yōu)良的

2、α-半乳糖苷酶的發(fā)掘是一個亟待解決的關鍵問題.乳酸菌作為人們日常生活中的食用添加菌種已有上百年的歷史了，尚未見任何明顯得副作用，所以我們從此入手研究產α-半乳糖苷酶的乳酸菌，為工業(yè)化大規(guī)模生產提供一些必要的科學依據(jù)。
　　 本實驗從分離于泡菜的乳酸菌中篩選出了16株具有α-半乳糖苷酶活性的菌株，分別來源于6個不同的種。從每個種中挑選一株進行了α-半乳糖苷酶的生化特性研究。六株菌的粗酶液均表現(xiàn)出較高的α-半乳糖苷酶活性，其中來源于

3、干酪乳桿菌g4-1最高酶活力達到了19.7 U/ml，所有α-半乳糖苷酶活性的差異明顯，都有不同的最適溫度和最適pH值。六株菌都能有效的降解棉子糖，其降解產酸能力與酶活性有著直接的聯(lián)系。
　　 為了進一步克隆表達α-半乳糖苷酶基因的需要，我們挑選了g4-1作為研究對象，對其粗酶液的α-半乳糖苷酶溫度、pH的穩(wěn)定性及金屬離子Cu2+，F(xiàn)e2+，Cd2+，Ni+，Zn2+，Mg2+的影響進行了研究.實驗結果表明g4-1α-半乳糖苷酶

4、高溫不穩(wěn)定，酶活對pH比較敏感，在pH5以下及pH8以上α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性較差，在pH5-8之間保存一小時，酶活均達到50％以上。大多數(shù)金屬離子對酶活性沒有很大影響，只有Ni+使酶活性降到45.27％。
　　 利用Cazy數(shù)據(jù)庫中已登錄的干酪乳桿菌的α-半乳糖苷酶的序列進行了比對，設計了兩條特異性引物，PCR擴增出了一條大小為2292bp的agaI基因，將該基因連接到pET-29a上，在E.coil BL21中進行了重組表達。