乳酸桿菌β-半乳糖苷酶重疊基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、β-半乳糖苷酶，簡(jiǎn)稱乳糖酶，廣泛存在于植物、真菌以及動(dòng)物腸道細(xì)菌中。該酶水解乳糖的糖苷鍵，分解乳糖為半乳糖和葡萄糖，或發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷作用生成低聚半乳糖。乳糖酶主要用于生產(chǎn)低乳糖牛奶以緩解乳糖不耐受癥，近年來(lái)其在保健食品--低聚半乳糖生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用也備受關(guān)注，市場(chǎng)需求逐年擴(kuò)大。因此，對(duì)乳糖酶的研究不僅具有理論意義，還有巨大的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
　　本研究主要目的是將一個(gè)編碼異源二聚體乳糖酶蛋白的重疊基因在真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)簡(jiǎn)并

2、PCR和熱不對(duì)稱交錯(cuò) PCR（TAIL-PCR）技術(shù)，從產(chǎn)乳糖酶的卷曲乳酸桿菌（Lactobacillus crispatus）B470中克隆得到乳糖酶基因，命名為 bg2-470。bg2-470全長(zhǎng)2815 bp，(G+C)％含量43%，編碼946個(gè)氨基酸（包括大小兩個(gè)亞基），無(wú)信號(hào)肽序列。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析，確定 bg2-470是屬于糖基水解酶第2家族的乳糖酶基因，與Lactobacillus crispatus ST1相似性最高，達(dá)

3、99%。
　　將bg2-470分別在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3)和畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115中進(jìn)行了異源表達(dá)。選取高表達(dá)酵母菌株在3 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)微濾，超濾，AKTA離子交換層析，凝膠過(guò)濾層析等純化步驟得到了目的蛋白。酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，該酶最適溫度為50℃，最適 pH值為7.0，比活力為221 U/mg，Km為0.964 mmol/L，Vmax為466 nmo