乳酸桿菌β-半乳糖苷酶重疊基因的克隆、表達及酶學性質分析.pdf

1、β-半乳糖苷酶，簡稱乳糖酶，廣泛存在于植物、真菌以及動物腸道細菌中。該酶水解乳糖的糖苷鍵，分解乳糖為半乳糖和葡萄糖，或發(fā)生轉糖苷作用生成低聚半乳糖。乳糖酶主要用于生產(chǎn)低乳糖牛奶以緩解乳糖不耐受癥，近年來其在保健食品--低聚半乳糖生產(chǎn)領域的應用也備受關注，市場需求逐年擴大。因此，對乳糖酶的研究不僅具有理論意義，還有巨大的社會價值和經(jīng)濟效益。
　　本研究主要目的是將一個編碼異源二聚體乳糖酶蛋白的重疊基因在真核系統(tǒng)中進行表達。通過簡并

2、PCR和熱不對稱交錯 PCR（TAIL-PCR）技術，從產(chǎn)乳糖酶的卷曲乳酸桿菌（Lactobacillus crispatus）B470中克隆得到乳糖酶基因，命名為 bg2-470。bg2-470全長2815 bp，(G+C)％含量43%，編碼946個氨基酸（包括大小兩個亞基），無信號肽序列。經(jīng)過序列比對分析，確定 bg2-470是屬于糖基水解酶第2家族的乳糖酶基因，與Lactobacillus crispatus ST1相似性最高，達

3、99%。
　　將bg2-470分別在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3)和畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115中進行了異源表達。選取高表達酵母菌株在3 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)過微濾，超濾，AKTA離子交換層析，凝膠過濾層析等純化步驟得到了目的蛋白。酶學性質分析顯示，該酶最適溫度為50℃，最適 pH值為7.0，比活力為221 U/mg，Km為0.964 mmol/L，Vmax為466 nmo