25014.轉糖基活性β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株篩選、克隆表達及酶學性質研究

1、獨創(chuàng)性聲明1930_『13本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得江南大學或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。簽名：姿茬龔日期幽僻月『7日關于論文使用授權的說明本學位論文作者完全了解江南大學有關保留、使用學位論文

2、的規(guī)定：江南大學有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質論文的內(nèi)容相一致。保密的學位論文在解密后也遵守此規(guī)定。簽名：觸導師簽名：1墮翌墮日期渺。。年(，月‘7El摘要摘要p半乳糖苷酶(EC32123)俗稱乳糖酶，不僅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，而且具有轉糖基活性，是

3、一種重要的糖苷水解酶，在食品、醫(yī)藥和分析化學等領域都有重要應用。近年來隨著糖生物學的發(fā)展，轉糖基p半乳糖苷酶逐漸成為糖類合成的重要工具酶，被用于合成各種糖基化合物，乳果糖、低聚半乳糖就是其中比較突出的兩種。本課題旨在從自然界篩選得到一株水解活力較高、兼具轉糖基活性、生長發(fā)育良好的p半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株，對其進行菌種鑒定，緊接著從基因克隆、基因表達、重組菌誘導表達條件優(yōu)化、重組酶酶學性質研究以及酶法合成低聚糖等方面進行系統(tǒng)研究，進而為其在功

4、能性低聚糖生產(chǎn)領域的應用打下一定基礎。通過四級篩選，從自然界中得到一株水解活力相對較高、兼具轉糖基活性、生長發(fā)育良好的B半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株，借助菌落形態(tài)觀察、生化指標測定以及16SrDNA序列分析，鑒定其為Klebsiellapneumoniae285。通過單因子試驗和正交試驗對Klebsiellapneumoniae285產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基組成為乳糖50∥L，蛋白胨20∥L，酵母浸膏109／L，氯化鈉3eCt；最優(yōu)發(fā)酵條

5、件為種齡6h，起始pH70，接種量3％，裝液量40mL／250mL，30℃下發(fā)酵8h。最優(yōu)條件下產(chǎn)酶活力為721U／mL。以乳糖為底物Klebsiellapneumoniae285B半乳糖苷酶催化生成低聚糖，反應液組分包括果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚糖(包括轉移二糖、低聚三糖)。反應液總糖中，葡萄糖占97％，乳糖占269％，低聚糖占537％。以乳糖、果糖為底物時，反應液總糖中，果糖占214％，葡萄糖占51％，乳糖占234％，低聚糖占

6、450％。PCR擴增Klebsiellapneumoniae285B一半乳糖苷酶編碼基因，構建DH50／pMDl8TbgaB以及DH50／pMDl8一TLacZ兩株克隆菌株，委托測序，結果表明兩段序列與已報道的不同亞種對應序列的同源性均極高。成功構建BL21／pET28a()bgaB以及BL21／pET28a()LacZ兩株表達菌株，同時實現(xiàn)酶活表達。通過單因素試驗對兩株重組菌的誘導表達條件進行優(yōu)化，結果得到BL21／pET28a()b

7、gaB重組菌的最佳誘導條件為誘導時機135min、IPTG濃度02mmol／L、誘導長度8h；BL21／pET28a()LacZ重組菌的最佳誘導條件為誘導時機120min、IPTG濃度06mmol／L、誘導長度9h。用金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠層析柱分離純化帶(His)6標簽的重組酶，得到兩種重組酶的最適咪唑洗脫濃度均為350mmol／L，電泳檢測均獲得單一條帶。純化后bgaB重組B半乳糖苷酶的比酶活為18545U／rag，是純化前比酶活的9