耐熱β-半乳糖苷酶的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、β-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.23)俗稱乳糖酶，該酶能水解β-1，4糖苷鍵在乳品加工中常用于水解牛奶中的乳糖制備低乳糖奶，可有效緩解人體乳糖不耐癥，促進(jìn)乳品工業(yè)的發(fā)展。耐熱β-半乳糖苷酶，或稱高溫乳糖酶，以其良好的熱穩(wěn)定性和較高溫度下的水解特性使之具有常溫乳糖酶無法比擬的優(yōu)越性。近年來，高溫乳糖酶尤其是細(xì)菌來源的中性、耐熱乳糖酶成為研究的熱點(diǎn)。
　　 本文圍繞一種來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的耐熱β-半乳糖苷酶(bgaB)，從基因

2、克隆、表達(dá)及分泌等方面進(jìn)行了較為深入的研究?？莶菅挎邨U菌是一種食品級(jí)微生物，在食品生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。本文選用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含有不同信號(hào)肽的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒，將bgaB基因插入到四種質(zhì)粒表達(dá)單元中進(jìn)行重組表達(dá)，其中重組菌株WB600-pMAwprA-bgaB搖瓶發(fā)酵的最高酶活達(dá)到0.37U/mL，實(shí)現(xiàn)了bgaB在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。
　　 本文嘗試了bgaB在畢赤酵母中的表達(dá)。構(gòu)建pPIC9k-bgaB重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化到畢

3、赤酵母GS115中構(gòu)建重組轉(zhuǎn)化子，用含G418的YPD平板篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，并驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化子的正確性后，用甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)目的基因。結(jié)果在發(fā)酵后的菌液破壁上清液中檢測(cè)到耐熱乳糖酶的酶活，最高活性為0.26U/mL，SDS-PAGE電泳也在70kD處檢測(cè)到目的條帶，表明bgaB基因在畢赤酵母中得到了表達(dá)。
　　 乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)也是近年來研究的熱點(diǎn)，本文構(gòu)建重組質(zhì)粒pKLAC1-bgaB，電轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母GG799中構(gòu)

4、建重組轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化子正確性后進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。結(jié)果在發(fā)酵后的菌液破壁上清液中檢測(cè)到耐熱乳糖酶的酶活，最高活性為0.068U/mL，SDS-PAGE電泳也在70kD處檢測(cè)到目的條帶，表明bgaB基因在乳酸克魯維酵母中得到了表達(dá)。
　　 本文研究了bgaB基因在三種不同表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，結(jié)果表明bgaB基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)效果要優(yōu)于真核表達(dá)系統(tǒng)，達(dá)到了0.371U/mL，并首次實(shí)現(xiàn)了bgaB基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。