家蠶中β-半乳糖苷酶基因的克隆表達(dá).pdf

1、β-半乳糖苷酶(β-D半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactosid.galatohydrofase，Ec3.2.1.23)通常被稱為乳糖酶，它能夠催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷鍵發(fā)生水解，還具有轉(zhuǎn)半乳糖的作用。β-半乳糖苷酶催化乳糖發(fā)生水解的實(shí)用意義較大，故研究較多。β-半乳糖苷酶的天然來(lái)源十分豐富，細(xì)菌、霉菌和酵母等微生物經(jīng)發(fā)酵可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。該酶在動(dòng)物體內(nèi)參與糖類物質(zhì)的代謝并同細(xì)胞的成熟、衰老關(guān)系密切。在植物體內(nèi)能

2、夠降解細(xì)胞壁的果膠和半纖維素，參與果蔬成熟。
　　 我們通過(guò)電子克隆、RT-PCR、3'RACE的方法從家蠶幼蟲(chóng)中擴(kuò)增到家蠶β-半乳糖苷酶基因的cDNA序列，并將其命名為BmGal(Bomby.moriβ-galactosidase)，提交到GenBank，登錄號(hào)為FJ571146。該cDNA序列全長(zhǎng)為215.bp，含有編碼半乳糖苷酶蛋白氨基酸序列完整的ORF，大小為182.bp，編碼606個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為6.kD，其

3、氨基酸序列與無(wú)脊椎動(dòng)物中該蛋白的氨基酸序列同源性較高，含有完整的糖基水解酶GHF-42保守結(jié)構(gòu)域。本研究構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-B.Gal，將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用終濃度為0 mM的IPTG誘導(dǎo)重組菌后，作SDS-PAGE分析，在7.kD左右的位置有一條與預(yù)期值相符的特異性蛋白條帶。利用ONPG為底物檢測(cè)該表達(dá)產(chǎn)物，未檢出生物活性。本研究還構(gòu)建了重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-γ-B.Gal，將該重組質(zhì)