山羊乳腺特異性載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染.pdf

1、基因打靶通過DNA轉(zhuǎn)移手段將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞或組織中，利用外源DNA序列與靶細(xì)胞內(nèi)基因組中部分DNA序列間的同源性使它們在分裂前期發(fā)生DNA間的同源重組，從而對靶細(xì)胞基因組上的某一確定位點(diǎn)或座位進(jìn)行精確的遺傳修飾的一門新技術(shù)。乳腺生物反應(yīng)器是基于胚胎操作和轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺，外源基因?qū)雱游锘蚪M中并利用內(nèi)源基因的啟動元件使外源基因在動物乳腺中表達(dá)，并利用動物乳腺的分泌能力從乳汁中獲得具有重要使用價(jià)值的藥用蛋白等外源蛋白的一類轉(zhuǎn)基因動物

2、的總稱。隨機(jī)整合將外源基因隨機(jī)導(dǎo)入靶細(xì)胞基因組中，由于“位置效應(yīng)”而導(dǎo)致外源基因表達(dá)低下甚至沉默。為提高外源蛋白在轉(zhuǎn)基因動物中的表達(dá)量，本研究以基因打靶等技術(shù)構(gòu)建山羊乳腺特異性載體，并通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和細(xì)胞篩選來獲得中靶轉(zhuǎn)基因山羊胎兒成纖維細(xì)胞，以中靶體細(xì)胞為核供體細(xì)胞生產(chǎn)乳腺生物反應(yīng)器動物，解決了外源基因由于隨機(jī)整合而產(chǎn)生“位置效應(yīng)”這一難題，并利用乳蛋白基因的啟動元件在乳腺中高效表達(dá)外源基因。 本試驗(yàn)以山羊β-酪蛋白基因座為打靶

3、位點(diǎn)，從西農(nóng)薩能奶山羊血液中提取DNA基因組，利用LA-PCR分兩段擴(kuò)增了山羊的β-酪蛋白基因，經(jīng)TA克隆和鑒定后再用LA-PCR的方法從中克隆了該基因的5’端包括調(diào)控序列和信號肽在內(nèi)的3 kb的DNA序列和3'端2 kb的DNA序列作為兩條同源臂。同時(shí)以在兩個(gè)LoxP之間插有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)并在兩個(gè)LoxP外側(cè)各有一個(gè)皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的通用性打靶載體pA2T為骨架載體，構(gòu)建了乳腺特異性條件性基因打靶載

4、體。 采用具有廣譜抗菌、抗病毒、改善免疫、組織修復(fù)、改善組織局部血液循環(huán)和分解膿液等作用的人溶菌酶基因和具有溶解血塊、保持血管的暢通等作用且半衰期相對較長的指形區(qū)缺乏的人組織纖溶酶原激活劑基因?yàn)榇虬休d體的外源目的基因，兩者均通過PCR從帶有該基因的載體中克隆出來的，并通過酶切和連接的方法構(gòu)建打靶載體。另外，試驗(yàn)以帶有核定位信號的AcGFP基因?yàn)闃?biāo)記基因，外源目的基因通過具有獨(dú)立起始翻譯隨后基因作用的IRES序列與AcGFP基因相

5、聯(lián)系。 以質(zhì)粒pEGFP-C1為骨架載體，先通過改造GFP基因ATG附近的序列使GFP高效表達(dá)，再將具有增強(qiáng)剪接作用的間插序列(IVS)與IRES序列與GFP基因相連，再在IVS前加入另一個(gè)帶有多克隆位點(diǎn)的IVS，構(gòu)建了載體p3I-GFP，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染確實(shí)發(fā)現(xiàn)載體p3I-GFP及去除了MluI位點(diǎn)的p3I-GFPN能夠高效表達(dá)標(biāo)記基因，且熒光亮度要明顯高于購買的pIRES2-AcGFP-Nuc載體。再以p3I-GFPN為骨架載體

6、，將人溶菌酶基因?qū)攵嗫寺∥稽c(diǎn)，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)的確能夠表達(dá)綠色熒光蛋白。在此基礎(chǔ)上，在CMV啟動子和人溶菌酶基因之間插入山羊CSN2的啟動子，再將GFP基因用從人胎盤中以PCR的方法擴(kuò)增獲得的干擾素A基因替代，最終構(gòu)建了一個(gè)乳腺中獨(dú)立表達(dá)人溶菌酶和人干擾素蛋白的載體，用于乳腺炎防治的研究。為獲得中靶山羊胎兒成纖維細(xì)胞株，本試驗(yàn)以山羊胎兒成纖維細(xì)胞為打靶體細(xì)胞，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞后用含800 μg/ml的遺傳霉素初步篩選培養(yǎng)，7天后