mTOR特異性siRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、研究目的:
　　構(gòu)建并篩選可表達 mTOR基因特異性 siRNA的慢病毒,并在此基礎(chǔ)上采用巨噬細胞特異性啟動子聯(lián)合重組酶表達基因構(gòu)建可在巨噬細胞內(nèi)特異表達siRNA的慢病毒表達載體,為后續(xù)體內(nèi)外研究其抗 Mtb感染的效果及機制奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.根據(jù) mTOR基因的 mRNA序列選擇3條靶序列,根據(jù)每條靶序列按siRNA設(shè)計原則設(shè)計相應(yīng)的 shRNA,同時根據(jù)其中一條 shRNA序列設(shè)計一條長度及堿基組

2、成與之完全一致,但堿基順序被隨機打亂的序列作為對照 shRNA序列。針對每條 shRNA各設(shè)計一對單鏈寡聚脫氧核苷酸,經(jīng)緩慢退火后形成可表達相應(yīng) shRNA的雙鏈 DNA,通過限制性內(nèi)切酶 HpaⅠ和 XhoⅠ克隆入慢病毒表達框架質(zhì)粒 pSicoR中,獲取 pSicoR-mTOR干擾質(zhì)粒并命名為 pSM系列載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α后,篩選陽性克隆、提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定正確后進行 DNA測序。
　　2.將重組慢病毒表達載體(pS

3、M系列質(zhì)粒)、慢病毒包裝質(zhì)粒 psPAX2、包膜蛋白質(zhì)粒 pMD2.G按照一定比例混合共轉(zhuǎn)染293T細胞,收集含有慢病毒顆粒的上清液,超濾離心,濃縮病毒顆粒。將慢病毒顆粒感染293T細胞,利用逐孔稀釋法在倒置熒光顯微鏡下檢測熒光表達情況,并計算病毒的滴度。采用適當?shù)味鹊穆《绢w粒感染小鼠巨噬細胞 RAW264.7,48h后,觀察慢病毒顆粒感染RAW264.7細胞的情況。采用實時熒光定量 PCR和 Western blot檢測巨噬細胞內(nèi)m

4、TOR基因表達的變化。
　　3.利用 PCR技術(shù)從質(zhì)粒 Cre-Amp中擴增出重組酶表達基因 Cre,克隆至質(zhì)粒 pBudCE4.1-SP146的 Hind III/Xba I位點中,獲得重組質(zhì)粒 pBudCE4.1-SP146-Cre,酶切鑒定正確后送測序。
　　4.采用 PCR技術(shù)分別擴增獲取 SP146-Cre片段、pSico的0至3808片段以及 pSico的3783至7566片段,然后利用 In-Fusion克隆技

5、術(shù)將 SP146-Cre克隆至 pSico中。將重組載體 pSico-SP146-Cre轉(zhuǎn)化大腸桿菌后選取陽性克隆菌,采用菌落 PCR方法進行重組質(zhì)粒鑒定,鑒定成功后送測序驗證。
　　5.將 SP146啟動子調(diào)控的質(zhì)粒 pSico-SP146-Cre分別轉(zhuǎn)染293T、RAW264.7細胞,通過 SP146啟動子調(diào)控 Cre/LoxP系統(tǒng)情況下,通過綠色熒光的表達模式觀察評價巨噬細胞特異性啟動子的特異性以及 SP146調(diào)控下的 Cr

6、e/LoxP系統(tǒng)的功能。
　　研究結(jié)果:
　　1.酶切及測序的結(jié)果顯示,mTor特異性 siRNA表達序列及對照序列均正確插入到質(zhì)粒 pSicoR中,成功構(gòu)建了 mTOR基因特異性的 siRNA慢病毒表達載體pSM1, pSM2, pSM3及對照 siRNA表達載體 pSM4。
　　2.利用293T細胞包裝重組慢病毒表達載體 pSM1/2/3/4,生產(chǎn)出慢病毒顆粒后進行病毒濃縮,經(jīng)病毒滴度測定,四組慢病毒 lenti-

7、pSM1/2/3/4的滴度分別是6×106TU/ml、1×106TU/ml、4×106TU/ml、2.5×106TU/ml。四種重組慢病毒顆粒感染 RAW264.7細胞,48h后均可觀察到明亮的綠色熒光,表明重組慢病毒能有效感染 RAW264.7細胞。
　　3.實時熒光定量 PCR及 Western blot檢測的結(jié)果相一致,均證實了lenti-pSM1組、lenti-pSM2組、lenti-pSM3組的 mTOR mRNA及蛋白

8、表達均受到抑制,其 mTOR mRNA表達水平的抑制率分別是24.1％、59.3%、41.1%,蛋白表達水平與空白對照組(0.9567±0.021)及 lenti-pSM4組(0.9200±0.030)相比三實驗組的灰度值分別為:0.9033±0.025、0.883±0.031、0.893±0.032,其中l(wèi)enti-pSM2組為最佳干擾效果組。
　　4.菌落 PCR及測序結(jié)果證實,MФ特異性啟動子序列 SP146及 Cre基因片

9、段已成功插入質(zhì)粒 pSico中,成功構(gòu)建了慢病毒表達載體 pSico-SP146-Cre。將該重組載體及轉(zhuǎn)染入293T及 RAW264.7細胞,觀察到其在293T細胞中有很強的綠色熒光,但是在 RAW264.7細胞中幾乎沒有綠色熒光。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了針對 mTOR基因干擾序列的系列慢病毒表達載體 pSM。
　　2.完成了慢病毒的包裝和濃縮,成功地利用構(gòu)建的重組慢病毒載體生產(chǎn)的慢病毒顆粒感染了 RAW26