APE1特異性siRNA慢病毒表達載體的構建及其在人肝癌MHCC97-H細胞中APE1基因沉默效應的觀察.pdf

1、目的：
　　 構建慢病毒表達載體LV-APE1-shRNA，觀察其介導的RNA干擾對人高侵襲肝癌細胞株MHCC97-H中APE1基因mRNA和蛋白的表達的影響，并進行功能學檢測分析，為進一步探討APE1在肝癌侵襲和轉移中的作用機制提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 設計4對干擾靶序列，分別與pGCSIL-GFP載體連接、轉化、并測序鑒定，將重組質粒命名為KD1～KD4。通過Western blot篩選最

2、有效的靶點，將篩選到的重組質粒與pHelper1.0，pHelper2.0共轉染293T細胞，包裝生產慢病毒顆粒并測定其病毒滴度。將包裝產生的慢病毒顆粒感染MHCC97-H細胞，通過RT-PCR和Westem blot檢測其干擾效率，通過免疫細胞化學觀察APE1表達的定位變化；利用噻唑蘭比色(MTT)方法檢測APE1干擾前后MHCC97-H細胞的增殖能力的變化；應用流式細胞術(FCM)檢測APE1基因抑制后MHCC97-H細胞的周期變化

3、；應用體外黏附實驗觀察APE1基因抑制前后MHCC97-H細胞黏附能力的變化；通過Transwell侵襲實驗觀察APE1基因抑制前后，MHCC97-H細胞的趨化運動能力和侵襲能力的變化。
　　 結果：
　　 1.通過PCR篩選陽性克隆和DNA測序鑒定，與設計的序列一致，通過Westem blot篩選到KD3的干擾效率達90％以上。將KD3與pHelper1.0，pHelper2.0共轉染腎胚293T細胞，包裝生產慢病毒顆

4、粒LV-APE1-shRNA，測定其病毒滴度為4x108TU/mL。
　　 2.LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H細胞后，APE1基因的mRNA和蛋白的表達量與未感染組和空載體病毒感染組相比均明顯下降，免疫細胞化學顯示APE1的表達從胞核、胞質表達轉移至僅部分胞核弱表達。
　　 3.體外增殖實驗顯示：與未感染組和空載體病毒感染組相比，LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H細胞后，MHCC97-H細胞的

5、體外增殖能力下降。細胞周期實驗顯示：與未感染組和空載體病毒感染組相比，LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H細胞后，細胞的G1期延長，而G2期和S期相對縮短。
　　 4.在體外黏附、侵襲和趨化運動實驗中，與未感染組和空載體病毒感染組相比，LV-APE1-shRNA組的MHCC97-H細胞的黏附能力、侵襲能力及趨化運動能力均不同程度的下降。
　　 結論：
　　 1.本課題所構建的慢病毒載體可顯著、穩(wěn)定的抑制