APE1的氧化還原功能在卵巢癌鉑類耐藥中的作用研究.pdf

1、卵巢癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一,其惡性程度在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占第1位。由于缺乏可靠的早期檢測方法,約70％的患者初次診斷時已經(jīng)為III或IV期,并且出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移,嚴重影響疾病的治療效果,降低患者生存質(zhì)量。目前國內(nèi)外對卵巢癌初診患者采用的標準治療方案是聯(lián)合積極徹底的腫瘤細胞減滅術(shù)和以鉑類為基礎的化療治療。根治性手術(shù)和化療方案的進步發(fā)展使得卵巢癌的治療有所改善。但是,腫瘤細胞原發(fā)性或繼發(fā)性的化療耐藥是影響化療效果,造成腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)

2、移及死亡率居高不下的重要原因,給臨床治療帶來極大困擾。因此,研究卵巢癌復發(fā)和化療耐藥的機制并采取有效的預防和治療措施已成為卵巢癌治療研究的當務之急。
　　脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(Apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE1)是DNA堿基切除修復(Base excision repair,BER)途徑中的一種多功能蛋白酶,不僅具有核酸內(nèi)切酶活性,在DNA BER途徑中發(fā)揮關鍵限速酶的作用,而且還能

3、通過其氧化還原功能調(diào)控多種重要轉(zhuǎn)錄因子的活性,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、氧化應激、細胞周期調(diào)控及凋亡等多種關鍵的細胞反應。APE1在DNA損傷修復和凋亡通路調(diào)控兩大途徑中均發(fā)揮重要作用。多項研究結(jié)果均表明,APE1的表達不僅與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后相關,而且與多種腫瘤的放化療敏感性相關。鑒于 APE1上述的功能特點,我們推測 APE1在腫瘤細胞化療耐藥中扮演著重要角色,可能成為極具潛力的腫瘤治療靶點。
　　我們前期發(fā)現(xiàn)①APE1的表達

4、和細胞定位與卵巢癌發(fā)生發(fā)展、鉑類化療敏感性及預后相關;②卵巢癌順鉑耐藥株A2780/cis中APE1的表達水平顯著高于卵巢癌順鉑敏感株A2780;③高表達APE1能顯著降低卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。綜合前期的研究基礎,我們提出并證實了APE1在介導卵巢癌鉑類耐藥中發(fā)揮著重要作用。
　　近年來多項研究證實,APE1的DNA修復功能在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化療耐藥及預后中扮演著重要角色。APE1具有3’-5’核酸外切酶作用,在錯配的脫氧

5、核糖核苷類似物的切除中發(fā)揮作用,抑制這種作用能夠增加吉西他濱類化療藥物的治療作用。體內(nèi)體外實驗均表明,通過 RNA干擾或特異性小分子抑制劑抑制 APE1的DNA修復功能,并與放化療聯(lián)合應用,在一定程度上能夠增強放化療對腫瘤細胞的殺傷能力。
　　盡管針對 APE1在卵巢癌鉑類耐藥過程中發(fā)揮的作用取得了一些研究結(jié)果,但仍有很多問題亟待深入探討:我們對其DNA修復功能已有充分的了解,但對其氧化還原功能卻知之甚少。APE1的氧化還原功能在

6、其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、氧化應激、細胞周期調(diào)控及凋亡等多種關鍵細胞反應中發(fā)揮著重要作用,那么 APE1的氧化還原功能在卵巢癌鉑類耐藥形成中又扮演怎樣的角色?干預 APE1是否能有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥呢?
　　為此,我們在前期研究的基礎上,進行了下列研究工作:?根據(jù) APE1結(jié)構(gòu)功能特點,構(gòu)建含有 APE1基因及其氧化還原區(qū)的重組腺病毒 Ad5-APE1-EGFP和Ad5-Redox-APE1-EGFP;?將Ad5-APE1-EGFP和

7、Ad5-Redox-APE1-EGFP重組腺病毒分別感染卵巢癌細胞,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(EGFP)的表達檢測感染情況,qRT-PCR和 Western blot分別檢測重組腺病毒感染后卵巢癌細胞中 APE1 mRNA和蛋白水平變化;?MTT、平板克隆形成實驗及侵襲實驗檢測感染APE1不同重組腺病毒后卵巢癌細胞增殖能力及侵襲能力的變化;?藥物敏感性實驗檢測感染 APE1不同重組腺病毒,對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響;?流式細胞術(shù)檢

8、測感染 APE1不同重組腺病毒后卵巢癌細胞周期的變化;?Hoechst33258染色法檢測 APE1不同重組腺病毒感染后,順鉑誘導的卵巢癌細胞凋亡的變化;?激光共聚焦檢測APE1不同重組腺病毒感染后卵巢癌細胞中APE1的亞細胞定位;?體內(nèi)實驗建立卵巢癌裸鼠皮下荷瘤模型,進一步觀察 APE1及其氧化還原功能在卵巢癌化療耐藥中的重要作用及其對腫瘤增殖的影響;?構(gòu)建針對APE1氧化還原區(qū)的Redox-APE1 siRNA慢病毒下調(diào)Redox-

9、APE1表達后,通過MTT法、藥物敏感性實驗及流式細胞術(shù)檢測細胞周期觀察其對卵巢癌細胞生物學行為的影響;?qRT-PCR檢測改變APE1表達水平對耐藥相關基因的影響;⑴qRT-PCR和Western blot法檢測改變APE1表達水平對凋亡相關基因的影響;⑵qRT-PCR檢測改變APE1表達水平對Jak/STAT通路基因表達的影響;⑶在卵巢癌A2780細胞中上調(diào)和下調(diào) APE1的表達,利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測了APE1表達水平對S

10、TAT3啟動子活性的影響。
　　通過以上實驗我們獲得了下列結(jié)果:?成功構(gòu)建含有 APE1基因及其氧化還原區(qū)的重組腺病毒Ad5-APE1-EGFP和Ad5-Redox-APE1-EGFP;?將Ad5-APE1-EGFP和Ad5-Redox-APE1-EGFP重組腺病毒分別感染卵巢癌細胞后,熒光顯微鏡下可觀察到95%以上細胞能夠表達EGFP,qRT-PCR和Western blot分別表明重組腺病毒感染后卵巢癌細胞中APE1 mRNA

11、和蛋白水平均顯著升高(P<0.05);?MTT、平板克隆形成實驗及侵襲實驗表明,感染 APE1不同重組腺病毒后能夠促進卵巢癌細胞的增殖,顯著增強卵巢癌細胞的侵襲能力(P<0.05);?藥物敏感性實驗證實感染APE1不同重組腺病毒后,卵巢癌細胞對順鉑的敏感性顯著下降(P<0.05);?流式細胞術(shù)結(jié)果表明,感染APE1不同重組腺病毒后,卵巢癌細胞周期G0/G1期比例下降,S期比例增加;?Hoechst33258染色法顯示,APE1不同重組腺

12、病毒感染后,順鉑誘導的卵巢癌細胞凋亡發(fā)生減少;?激光共聚焦檢測結(jié)果顯示,Redox-APE1重組腺病毒感染后卵巢癌細胞中APE1表達主要定位于細胞核,而APE1重組腺病毒感染后卵巢癌細胞中 APE1表達主要表現(xiàn)為細胞核或細胞漿/細胞核共表達;?成功建立卵巢癌裸鼠皮下荷瘤模型,通過體內(nèi)實驗進一步驗證 APE1及其氧化還原功能在卵巢癌化療耐藥中的重要作用及其對腫瘤增殖的影響;?成功構(gòu)建 Redox-APE1 siRNA慢病毒下調(diào)Redox-

13、APE1表達后,能夠抑制卵巢癌細胞增殖,導致G1/S期阻滯,并增加其對順鉑的敏感性(P<0.05);?Real-time PCR結(jié)果表明在卵巢癌A2780細胞和 A2780/cis細胞中高表達的APE1及 Redox-APE1通過上調(diào)多藥耐藥基因MDR1、MRP4及ABCG2的mRNA水平,下調(diào) TOPOⅡmRNA水平;而在卵巢癌 SKOV3細胞和 SKOV3/cis細胞中,高表達全長 APE1及 Redox-APE1在顯著上調(diào)MDR1

14、同時,能夠明顯增加MRP2、MRP5及MRP6的mRNA水平,從而參與調(diào)控多藥耐藥機制;⑴APE1及Redox-APE1的高表達能夠調(diào)控Bcl-2基因發(fā)揮抗凋亡作用,影響 Bax發(fā)揮促凋亡作用,進而抑制由順鉑誘導的卵巢癌細胞發(fā)生凋亡;⑵高表達APE1及Redox-APE1能夠顯著上調(diào)IL-6 mRNA水平和細胞上清中IL-6的含量,但卻幾乎不改變STAT3 mRNA水平,而下調(diào) APE1的表達卻能夠顯著抑制IL-6和STAT3 mRNA

15、水平,降低細胞上清中IL-6的含量;⑶雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明APE1的水平與STAT3啟動子轉(zhuǎn)錄活性呈正相關。給予IL-6刺激后高表達APE1及Redox-APE1能夠顯著上調(diào)STAT3啟動子相對活性,表明 Redox-APE1在 APE1調(diào)控STAT3啟動子活性中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果為其作為基因治療靶點提供有效依據(jù)。
　　綜上所述,本課題在前期工作基礎上成功構(gòu)建含有 APE1基因及其氧化還原區(qū)的重組腺病毒及下調(diào)Redo