APE1的氧化還原功能在卵巢癌鉑類(lèi)耐藥中的作用研究.pdf

1、卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一,其惡性程度在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占第1位。由于缺乏可靠的早期檢測(cè)方法,約70％的患者初次診斷時(shí)已經(jīng)為III或IV期,并且出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響疾病的治療效果,降低患者生存質(zhì)量。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)卵巢癌初診患者采用的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是聯(lián)合積極徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療治療。根治性手術(shù)和化療方案的進(jìn)步發(fā)展使得卵巢癌的治療有所改善。但是,腫瘤細(xì)胞原發(fā)性或繼發(fā)性的化療耐藥是影響化療效果,造成腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)

2、移及死亡率居高不下的重要原因,給臨床治療帶來(lái)極大困擾。因此,研究卵巢癌復(fù)發(fā)和化療耐藥的機(jī)制并采取有效的預(yù)防和治療措施已成為卵巢癌治療研究的當(dāng)務(wù)之急。
　　脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(Apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE1)是DNA堿基切除修復(fù)(Base excision repair,BER)途徑中的一種多功能蛋白酶,不僅具有核酸內(nèi)切酶活性,在DNA BER途徑中發(fā)揮關(guān)鍵限速酶的作用,而且還能

3、通過(guò)其氧化還原功能調(diào)控多種重要轉(zhuǎn)錄因子的活性,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等多種關(guān)鍵的細(xì)胞反應(yīng)。APE1在DNA損傷修復(fù)和凋亡通路調(diào)控兩大途徑中均發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究結(jié)果均表明,APE1的表達(dá)不僅與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān),而且與多種腫瘤的放化療敏感性相關(guān)。鑒于 APE1上述的功能特點(diǎn),我們推測(cè) APE1在腫瘤細(xì)胞化療耐藥中扮演著重要角色,可能成為極具潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)。
　　我們前期發(fā)現(xiàn)①APE1的表達(dá)

4、和細(xì)胞定位與卵巢癌發(fā)生發(fā)展、鉑類(lèi)化療敏感性及預(yù)后相關(guān);②卵巢癌順鉑耐藥株A2780/cis中APE1的表達(dá)水平顯著高于卵巢癌順鉑敏感株A2780;③高表達(dá)APE1能顯著降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。綜合前期的研究基礎(chǔ),我們提出并證實(shí)了APE1在介導(dǎo)卵巢癌鉑類(lèi)耐藥中發(fā)揮著重要作用。
　　近年來(lái)多項(xiàng)研究證實(shí),APE1的DNA修復(fù)功能在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化療耐藥及預(yù)后中扮演著重要角色。APE1具有3’-5’核酸外切酶作用,在錯(cuò)配的脫氧

5、核糖核苷類(lèi)似物的切除中發(fā)揮作用,抑制這種作用能夠增加吉西他濱類(lèi)化療藥物的治療作用。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均表明,通過(guò) RNA干擾或特異性小分子抑制劑抑制 APE1的DNA修復(fù)功能,并與放化療聯(lián)合應(yīng)用,在一定程度上能夠增強(qiáng)放化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。
　　盡管針對(duì) APE1在卵巢癌鉑類(lèi)耐藥過(guò)程中發(fā)揮的作用取得了一些研究結(jié)果,但仍有很多問(wèn)題亟待深入探討:我們對(duì)其DNA修復(fù)功能已有充分的了解,但對(duì)其氧化還原功能卻知之甚少。APE1的氧化還原功能在

6、其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等多種關(guān)鍵細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,那么 APE1的氧化還原功能在卵巢癌鉑類(lèi)耐藥形成中又扮演怎樣的角色?干預(yù) APE1是否能有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類(lèi)耐藥呢?
　　為此,我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上,進(jìn)行了下列研究工作:?根據(jù) APE1結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn),構(gòu)建含有 APE1基因及其氧化還原區(qū)的重組腺病毒 Ad5-APE1-EGFP和Ad5-Redox-APE1-EGFP;?將Ad5-APE1-EGFP和

7、Ad5-Redox-APE1-EGFP重組腺病毒分別感染卵巢癌細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)檢測(cè)感染情況,qRT-PCR和 Western blot分別檢測(cè)重組腺病毒感染后卵巢癌細(xì)胞中 APE1 mRNA和蛋白水平變化;?MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染APE1不同重組腺病毒后卵巢癌細(xì)胞增殖能力及侵襲能力的變化;?藥物敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染 APE1不同重組腺病毒,對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響;?流式細(xì)胞術(shù)檢

8、測(cè)感染 APE1不同重組腺病毒后卵巢癌細(xì)胞周期的變化;?Hoechst33258染色法檢測(cè) APE1不同重組腺病毒感染后,順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的變化;?激光共聚焦檢測(cè)APE1不同重組腺病毒感染后卵巢癌細(xì)胞中APE1的亞細(xì)胞定位;?體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立卵巢癌裸鼠皮下荷瘤模型,進(jìn)一步觀察 APE1及其氧化還原功能在卵巢癌化療耐藥中的重要作用及其對(duì)腫瘤增殖的影響;?構(gòu)建針對(duì)APE1氧化還原區(qū)的Redox-APE1 siRNA慢病毒下調(diào)Redox-

9、APE1表達(dá)后,通過(guò)MTT法、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;?qRT-PCR檢測(cè)改變APE1表達(dá)水平對(duì)耐藥相關(guān)基因的影響;⑴qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)改變APE1表達(dá)水平對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響;⑵qRT-PCR檢測(cè)改變APE1表達(dá)水平對(duì)Jak/STAT通路基因表達(dá)的影響;⑶在卵巢癌A2780細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào) APE1的表達(dá),利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)了APE1表達(dá)水平對(duì)S

10、TAT3啟動(dòng)子活性的影響。
　　通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們獲得了下列結(jié)果:?成功構(gòu)建含有 APE1基因及其氧化還原區(qū)的重組腺病毒Ad5-APE1-EGFP和Ad5-Redox-APE1-EGFP;?將Ad5-APE1-EGFP和Ad5-Redox-APE1-EGFP重組腺病毒分別感染卵巢癌細(xì)胞后,熒光顯微鏡下可觀察到95%以上細(xì)胞能夠表達(dá)EGFP,qRT-PCR和Western blot分別表明重組腺病毒感染后卵巢癌細(xì)胞中APE1 mRNA

11、和蛋白水平均顯著升高(P<0.05);?MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)表明,感染 APE1不同重組腺病毒后能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖,顯著增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05);?藥物敏感性實(shí)驗(yàn)證實(shí)感染APE1不同重組腺病毒后,卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著下降(P<0.05);?流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,感染APE1不同重組腺病毒后,卵巢癌細(xì)胞周期G0/G1期比例下降,S期比例增加;?Hoechst33258染色法顯示,APE1不同重組腺

12、病毒感染后,順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡發(fā)生減少;?激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示,Redox-APE1重組腺病毒感染后卵巢癌細(xì)胞中APE1表達(dá)主要定位于細(xì)胞核,而APE1重組腺病毒感染后卵巢癌細(xì)胞中 APE1表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞核或細(xì)胞漿/細(xì)胞核共表達(dá);?成功建立卵巢癌裸鼠皮下荷瘤模型,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證 APE1及其氧化還原功能在卵巢癌化療耐藥中的重要作用及其對(duì)腫瘤增殖的影響;?成功構(gòu)建 Redox-APE1 siRNA慢病毒下調(diào)Redox-

13、APE1表達(dá)后,能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖,導(dǎo)致G1/S期阻滯,并增加其對(duì)順鉑的敏感性(P<0.05);?Real-time PCR結(jié)果表明在卵巢癌A2780細(xì)胞和 A2780/cis細(xì)胞中高表達(dá)的APE1及 Redox-APE1通過(guò)上調(diào)多藥耐藥基因MDR1、MRP4及ABCG2的mRNA水平,下調(diào) TOPOⅡmRNA水平;而在卵巢癌 SKOV3細(xì)胞和 SKOV3/cis細(xì)胞中,高表達(dá)全長(zhǎng) APE1及 Redox-APE1在顯著上調(diào)MDR1

14、同時(shí),能夠明顯增加MRP2、MRP5及MRP6的mRNA水平,從而參與調(diào)控多藥耐藥機(jī)制;⑴APE1及Redox-APE1的高表達(dá)能夠調(diào)控Bcl-2基因發(fā)揮抗凋亡作用,影響 Bax發(fā)揮促凋亡作用,進(jìn)而抑制由順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡;⑵高表達(dá)APE1及Redox-APE1能夠顯著上調(diào)IL-6 mRNA水平和細(xì)胞上清中IL-6的含量,但卻幾乎不改變STAT3 mRNA水平,而下調(diào) APE1的表達(dá)卻能夠顯著抑制IL-6和STAT3 mRNA

15、水平,降低細(xì)胞上清中IL-6的含量;⑶雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明APE1的水平與STAT3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性呈正相關(guān)。給予IL-6刺激后高表達(dá)APE1及Redox-APE1能夠顯著上調(diào)STAT3啟動(dòng)子相對(duì)活性,表明 Redox-APE1在 APE1調(diào)控STAT3啟動(dòng)子活性中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果為其作為基因治療靶點(diǎn)提供有效依據(jù)。
　　綜上所述,本課題在前期工作基礎(chǔ)上成功構(gòu)建含有 APE1基因及其氧化還原區(qū)的重組腺病毒及下調(diào)Redo