APE1在放療誘導(dǎo)肺癌血管生成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤和癌癥死亡的主要原因，近30年生存改善并不明顯。目前85%以上的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌，手術(shù)、放療和化療是治療非小細(xì)胞肺癌最常用的三種方式。隨著放射腫瘤學(xué)的不斷發(fā)展，放療已經(jīng)逐漸成為多種類型惡性腫瘤局部治療的重要方法，也是目前治療非小細(xì)胞肺癌最有效的方法之一。然而肺癌單獨(dú)放療的療效是令人失望的，部分腫瘤會(huì)因放療抵抗出現(xiàn)局部控制失敗，更重要的是腫瘤對(duì)放療并不是完全被動(dòng)的。目前許多研究表明放療可能促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)

2、移，其機(jī)制之一與血管生成和促血管生成因子有關(guān)。放療可以同時(shí)刺激多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，改變VEGF等多種促血管生成因子在殘存腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞的表達(dá)。此過程可能涉及多個(gè)基因，但具體機(jī)制目前仍不完全清楚。放療聯(lián)合多基因多靶點(diǎn)的抗腫瘤治療已成為目前研究的新方向。
　　 APE1具有DNA損傷修復(fù)和氧化還原等多種功能，是VEGF等促血管生成因子的上游基因。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí)APE1對(duì)骨肉瘤血管生成具有調(diào)節(jié)作用及APE1在肺癌中表達(dá)增

3、高和亞細(xì)胞定位改變與化療抵抗有關(guān)。因此，我們推測(cè)APE1對(duì)肺癌血管生成和放療誘導(dǎo)肺癌血管生成可能具有調(diào)節(jié)作用。本研究首先檢測(cè)APE1與VEGF在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的表達(dá)，分析APE1與非小細(xì)胞肺癌腫瘤血管生成和預(yù)后的關(guān)系，然后進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)觀察人肺腺癌A549細(xì)胞APE1和VEGF表達(dá)與放射線照射的劑量效應(yīng)關(guān)系，并利用Ad5/F35-APE1 siRNA抑制A549細(xì)胞APE1表達(dá)，研究APE1在放射誘導(dǎo)A549細(xì)胞VEGF表達(dá)

4、和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及微血管形成能力影響中的作用。
　　 研究目的
　　 1.探討APE1在非小細(xì)胞肺癌中與腫瘤血管生成和預(yù)后的關(guān)系，分析APE1成為非小細(xì)胞肺癌抗腫瘤血管生成治療靶點(diǎn)的可能性；
　　 2.探討APE1在放療誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌血管生成中的作用及機(jī)制；
　　 3.探討以APE1為靶點(diǎn)抑制放療誘導(dǎo)肺癌血管生成聯(lián)合放療治療非小細(xì)胞肺癌的可能性和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法
　　

5、 1.APE1在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成和預(yù)后的關(guān)系：采用免疫組化法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織APE1和VEGF表達(dá)，并測(cè)定MVD，分析APE1、VEGF與MVD的關(guān)系，并分析三者及常見臨床病理因素與DFS的關(guān)系。
　　 2.肺癌細(xì)胞APE1和VEGF表達(dá)與放射線照射的劑量效應(yīng)關(guān)系：采用8MV X射線分別給予A549細(xì)胞2、4、6、8、10Gy單次照射，照射后48h Western blot檢測(cè)各組A549細(xì)

6、胞APE1蛋白表達(dá)和ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF蛋白，以及照射后24h RT-PCR檢測(cè)各組A549細(xì)胞VEGF mRNA，分析A549細(xì)胞APE1和VEGF表達(dá)與X射線照射劑量的關(guān)系。
　　 3.Ad5/F35-APE1siRNA抑制放射誘導(dǎo)肺癌血管生成的實(shí)驗(yàn)研究：采用重組腺病毒載體Ad5/F35-APE1 siRNA感染A549細(xì)胞，照射后48h Western blot檢測(cè)APE1蛋白表達(dá)驗(yàn)證APE1抑制情

7、況，再分別給予8MV X射線2、4、6、8、10Gy單次照射，照射后48h ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白，8MV X射線4Gy單次照射Ad5/F35-APE1 siRNA感染和未感染A549細(xì)胞，照射后24小時(shí)RT-PCR檢測(cè)各組A549細(xì)胞VEGF mRNA水平，用同樣處理后48h A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基與HUVEC進(jìn)行Transwell雙室共培養(yǎng)和管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)，觀察APE1在放射線照射A549細(xì)胞

8、誘導(dǎo)HUVEC遷移及微血管形成中的作用。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.APE1在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成和預(yù)后的關(guān)系：APE1、VEGF在NSCLC腫瘤組織中高表達(dá)率分別為77.94%和66.18%。APE1表達(dá)與性別、年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)，VEGF表達(dá)和MVD值與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。APE1與VEGF、APE1與MVD和VEG

9、F與MVD均呈正相關(guān)(r=0.369，P=0.000；r=0.256，P=0.003；r=0.387，P=0.000)。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及APE1、VEGF、MVD與DFS密切相關(guān)(P<0.05)。COX回歸模型多因素分析顯示，腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和VEGF表達(dá)是影響NSCLC患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 2.肺癌細(xì)胞APE1和VEGF表達(dá)與放射線照射的劑量效應(yīng)關(guān)系：Wester

10、n Blot顯示不同劑量X射線照射后48h A549細(xì)胞APE1蛋白水平均較未照射細(xì)胞明顯增加，RT-PCR結(jié)果顯示不同劑量X射線照射后24h A549細(xì)胞VEGF mRNA均較未照射細(xì)胞明顯增高，ELISA方法檢測(cè)顯示不同劑量X射線照射后48h A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中根據(jù)細(xì)胞數(shù)量標(biāo)化的VEGF蛋白分泌量也均較未照射細(xì)胞明顯增加，并具有劑量依賴性，APE1和VEGF表達(dá)趨勢(shì)一致，而單次照射劑量超過4Gy后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總VEGF蛋白

11、分泌量開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　 3.Ad5/F35-APE1siRNA抑制放射誘導(dǎo)肺癌血管生成的實(shí)驗(yàn)研究：Ad5/F35-APE1siRNA感染A549細(xì)胞后48h Western Blot顯示A549細(xì)胞APE1蛋白表達(dá)明顯抑制，抑制率約85%，同時(shí)抑制X射線照射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞APE1蛋白表達(dá)。RT-PCR和ELISA結(jié)果顯示抑制APE1表達(dá)后未照射A549細(xì)胞VEGF mRNA和VEGF蛋白分泌量均減少，抑制率大約是88

12、%和60%；抑制APE1表達(dá)后給予4Gy單次照射A549細(xì)胞VEGF mRNA水平和VEGF蛋白分泌量也降低，與單純4Gy照射細(xì)胞比較抑制率大約是88%和64%；其余不同劑量照射誘導(dǎo)的VEGF蛋白分泌抑制率大約是54%～65%；兩因素方差分析顯示X射線照射和APE1表達(dá)均對(duì)VEGF表達(dá)和分泌存在影響，兩者之間存在交互作用(P<0.01)。遷移實(shí)驗(yàn)和管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)顯示單次4Gy X射線照射后的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基在體外可

13、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC遷移和微血管形成，Ad5/F35-APE1 siRNA抑制A549細(xì)胞APE1表達(dá)后HUVEC遷移和微血管形成的上述誘導(dǎo)作用明顯減弱。
　　 結(jié)論
　　 1.APE1高表達(dá)與NSCLC腫瘤血管生成有密切關(guān)系，APE1并不是影響NSCLC患者無(wú)病生存的獨(dú)立預(yù)后因素，APE1可能通過調(diào)控VEGF促進(jìn)NSCLC腫瘤血管生成從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，影響NSCLC患者無(wú)病生存預(yù)后。
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14、5/F35-APE1 siRNA抑制人肺腺癌A549細(xì)胞APE1表達(dá)后A549細(xì)胞VEGF表達(dá)和分泌下降以及血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和微血管形成能力降低，在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)APE1參與調(diào)節(jié)NSCLC腫瘤血管形成，APE1是NSCLC抗血管生成治療的潛在分子靶點(diǎn)，可能具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.放射線照射以劑量依賴方式誘導(dǎo)A549細(xì)胞APE1和VEGF表達(dá)增強(qiáng)，兩者表達(dá)趨勢(shì)一致。Ad5/F35-APE1 siRNA可抑制A549細(xì)胞放射線