雙功能基因APE1與miRNAs相互調(diào)控介導骨肉瘤放療敏感性的機制研究.pdf

1、背景：放療是骨肉瘤治療的重要手段之一。放療抵抗是影響患者療效和預后的關(guān)鍵因素。前期研究表明，脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1)具有DNA損傷修復和氧化還原雙功能，在骨肉瘤放療抵抗中發(fā)揮核心調(diào)節(jié)作用，敲低APE1能顯著增強骨肉瘤放療敏感性。然而其介導骨肉瘤放療敏感性的機制不清。MicroRNAs(miRNAs)能在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)節(jié)靶基因的表達，對腫瘤發(fā)生、細胞凋亡和應激反應具有重要的調(diào)控作用，為研究和發(fā)現(xiàn)APE1基因調(diào)控通路和相互作用蛋

2、白，闡明APE1介導的骨肉瘤放療敏感性的機制提供了新的研究方向。此外，miRNAs作為內(nèi)源性的小分子，在調(diào)控腫瘤細胞放療敏感性中具有明顯的優(yōu)勢，為骨肉瘤的分子靶向治療提供了新的策略。晚近的研究陸續(xù)報道了p53等腫瘤關(guān)鍵基因相互作用的miRNAs，但與APE1相互作用的miRNAs國內(nèi)外鮮見報道。
　　 目的：旨在鑒定和研究APE1相互作用miRNAs及其在骨肉瘤放療抵抗中的作用。
　　 方法：⑴通過生物信息學、miRNA

3、s芯片和qRT-PCR篩選鑒定APE1-knockdown骨肉瘤細胞的miRNAs差異表達譜，分析其靶基因涉及的細胞生物學功能和信號通路。⑵通過生物信息學、EMSA、RNAi和qRT-PCR實驗初步驗證APE1-轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs的作用關(guān)系。⑶利用生物信息學、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、AP位點切除實驗及EMSA鑒定miRNAs對APE1的靶向調(diào)控作用，在細胞和動物水平驗證miRNAs靶向抑制APE1對骨肉瘤細胞放療后增殖和凋亡的影響。

4、
　　 結(jié)果：①APE1-knockdown骨肉瘤細胞中有13個miRNAs顯著變化，其中miR-451、miR-1290、miR-765、miR-483-5p、miR-513a-5p、miR-129-5p和miR-31上調(diào)，miR-29b、miR-197、let-7b、miR-324-5p、let-7i和miR-484下調(diào)，其靶基因分別涉及TGF-β、Wnt、MAPK和p53等細胞信號通路，與細胞生存、增殖、粘附和腫瘤發(fā)生有關(guān)

5、②生物信息學分析提示，轉(zhuǎn)錄因子與miRNAs啟動子區(qū)有結(jié)合位點;APE1-knockdown后可下調(diào)NF-κB的DNA結(jié)合活性，而抑制NF-κB可下調(diào)let-7b和let-7i的表達。③miR-513a-5p和miR-765能與APE1 mRNA3'UTR區(qū)結(jié)合抑制APE1蛋白表達;miR-513a-5p可抑制APE1的AP位點剪切活性和NF-κB、p53、AP-1的DNA結(jié)合活性;在細胞和動物水平給予X射線照射后，過表達miR-513

6、a-5p可增加凋亡，抑制骨肉瘤細胞增殖和Bcl-2的表達。
　　 結(jié)論：⑴APE1能直接影響骨肉瘤細胞miRNAs的表達;生物信息學分析表明APE1通過調(diào)控miRNAs可能影響下游靶基因的表達，參與腫瘤發(fā)生、細胞生存、增殖、粘附等生物學過程和多個信號通路，與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。⑵生物信息學分析表明APE1-轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs具有相互作用;初步證實APE1通過調(diào)控NF-κB的DNA結(jié)合活性可能調(diào)控let-7b和