APE1在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)Olaparib藥物敏感性的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 乳腺癌組織中APE1表達(dá)及臨床意義
　　目的:三陰性乳腺癌特征是免疫組化結(jié)果顯示HER2/ER/PR均為陰性，這種類型的乳腺癌預(yù)后較差，生物學(xué)行為特殊且缺少內(nèi)分泌治療和靶向治療的有效靶點(diǎn)，是制約乳腺癌臨床治療發(fā)展的瓶頸。近15％的三陰性乳腺癌患者存在DNA損傷修復(fù)基因的致病性突變，提示三陰性乳腺癌存在著與其他分子類型不同的克隆起源。在DNA堿基損傷修復(fù)中，APE1是其中的關(guān)鍵限

2、速酶。在本研究中，檢測(cè)APE1在乳腺癌中的表達(dá)，分析其與乳腺癌的臨床病理特征的關(guān)系，及APE1對(duì)三陰性乳腺癌患者預(yù)后的影響。
　　方法:采用免疫組化Envision兩步法檢測(cè)323例乳腺癌中APE1蛋白的表達(dá)，其中三陰性乳腺癌為108例。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS21.0軟件進(jìn)行。采用卡方檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)法針對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。生存分析采用Kaplan-Meier法。兩組生存率的比較采用log rank檢驗(yàn)進(jìn)行。多因素分析使用

3、Cox回歸模型。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行三次以上驗(yàn)證，并以P＜0.05定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:APE1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(其中非三陰組99.3％ Vs0.7％，P＜0.0001;三陰組85.6％ Vs14.4％，P＜0.0001)。其表達(dá)與腫瘤大小，人類表皮生長(zhǎng)因子2型受體，腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)，雌激素受體，臨床分期密切相關(guān)(P＜0.05)。即便在預(yù)后相對(duì)不佳的腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性組，APE1低表達(dá)也顯示比APE1高表達(dá)組

4、有更高的生存率(P=0.0427)。
　　結(jié)論:APE1在乳腺癌組織中明顯高于癌旁組織，提示可能與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。COX結(jié)果提示其高表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后不佳的獨(dú)立因子，可能成為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。
　　第二部分 三陰性乳腺癌中APE1對(duì)Olaparib(PARP1抑制劑)敏感性影響
　　目的:PARP-1是DNA單鏈修復(fù)的重要基因，APE1也參與DNA單鏈損傷修復(fù)。BRCA1是DNA雙鏈損傷修復(fù)的重要修復(fù)酶。當(dāng)BR

5、CA1缺陷且抑制PARP1功能時(shí)易產(chǎn)生聯(lián)合致死效果。但PARP1抑制劑的臨床研究并未顯示出在BRCA1突變的乳腺癌中有顯著的“高效”，其原因不清。由于APE1與PARP1在DNA堿基切除修復(fù)通路中的作用相似，之間的關(guān)系尚不明確。是否二者之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)，從而影響PARP1抑制劑的療效，有待于研究。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了BRCA1缺陷的三陰性乳腺癌HCC1937的APE1敲除株，觀察PARP1抑制劑作用于敲除株和野生株后對(duì)細(xì)胞株增殖及凋亡的影

6、響，明確PARP1與APE1的關(guān)系。
　　方法:通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立APE1敲除的HCC1937細(xì)胞穩(wěn)定株。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入PARP-1抑制劑Olaparib前后野生型HCC1937細(xì)胞的APE1表達(dá)，以及APE1敲除株和野生型HCC1937中PARP1的表達(dá)。通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)量APE1敲除株和野生型HCC1937加入Olaparib后的IC50值和生長(zhǎng)曲線。使用流失細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)過(guò)Olaparib處理后的A

7、PE1敲除株和野生型HCC1937的周期和凋亡情況。
　　結(jié)果:使用不同濃度PARP-1抑制劑Olaparib處理野生型HCC1937發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Olaparib為10M時(shí)，APE1表達(dá)降低;當(dāng)增加Olaparib的濃度為15M時(shí)，APE1表達(dá)降低更加顯著。在APE1敲除株HCC1937-APE1-KO中，內(nèi)源性PARP1表達(dá)也比野生型HCC1937減少。使用CCK8測(cè)量，與HCC1937相比，HCC1937-APE1-KO的IC50

8、明顯增加。生長(zhǎng)曲線表明，使用PARP1抑制劑第五天時(shí)，野生型和APE1敲除株的抑制率分別為68％和27％，說(shuō)明PARP1抑制劑對(duì)野生型HCC1937殺傷力更強(qiáng)。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量后發(fā)現(xiàn)，HCC1937經(jīng)過(guò)Olaparib40μM處理后引起更明顯的有絲分裂G2/M阻滯，而HCC1937-APE1-KO周期未有明顯變化;且HCC1937比HCC1937-APE1-KO的凋亡率顯著增加。
　　結(jié)論:使用PARP1抑制劑作用于HCC193