干擾乳腺癌細(xì)胞BAG-1基因表達(dá)及其對(duì)吉非替尼敏感性影響的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:
　　 乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜的過(guò)程。在基因水平上明確腫瘤的發(fā)生發(fā)展并尋求治療手段，尤其是癌基因激活，抑癌基因的失活及其相關(guān)相關(guān)藥物作用通路，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，凋亡障礙及其機(jī)制具有重要意義并受到了許多研究者的重視和關(guān)注。本文研究BAG-1基因(Bcl-2associatedathanogene-1)在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，分析干擾BAG-1基因表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性關(guān)系及BAG-1

2、參與腫瘤中表面生長(zhǎng)因子受體1、2的表達(dá)過(guò)程。探討乳腺癌靶向治療敏感性和耐藥性的影響因素。
　　 方法:
　　 培養(yǎng)應(yīng)用乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、T47D，通過(guò)基因干擾(siRNA)降低BAG-1的表達(dá)，并通過(guò)real-timePCR和Westernblot方法驗(yàn)證在基因干擾效率。應(yīng)用MTT法和FACS(流式細(xì)胞術(shù))等分別檢測(cè)BAG-1降表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼（表面生長(zhǎng)因子受體1抑制劑）的藥物反應(yīng)性、凋亡率變化

3、和周期阻滯情況。分別應(yīng)用real-timePCR和Westernblot方法檢測(cè)相關(guān)基因EGFR及HER-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.應(yīng)用有效序列BAG-1siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、T47D，在BAG-1SiRNA50nM轉(zhuǎn)染48h后，通過(guò)westernblot和real-timePCR實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)轉(zhuǎn)染組BAG-1蛋白和mRNA水平表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。在不

4、同時(shí)間，應(yīng)用不同濃度梯度的吉非替尼處理BAG-1降表達(dá)前后的MDA-MB-231、T47D，隨著濃度的升高，細(xì)胞的存活率亦逐漸降低，BAG-1降表達(dá)組的細(xì)胞生長(zhǎng)率率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　 2.通過(guò)FACS(流式細(xì)胞術(shù))檢測(cè)MDA-MB-231、T47D在BAG-1si-RNA干擾實(shí)驗(yàn)中對(duì)gefitinib10uM的反應(yīng)中不同的細(xì)胞的凋亡情況(MDA-MB-231:17.57％vs31.23％,P＜0.001;T4

5、7D:11.43％vs19.87％,P＜0.001)和周期G0/G1期阻止情況（MDA-MB-231:72.06％vs87.05％,P＜0.05;T47D:61.91％vs69.82％,P＜0.05）。在吉非替尼(gefitinib)作用于乳腺癌細(xì)胞中降低乳腺癌細(xì)胞中的BAG-1的表達(dá)能夠使癌細(xì)胞的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡率和G0/G1期的阻滯程度的增大，進(jìn)而出現(xiàn)藥物增敏作用。
　　 3.在MDA-MB-231和T47D的BAG-1siRN

6、A實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，BAG-1siRNA轉(zhuǎn)染組BAG-1蛋白和mRNA水平表達(dá)明顯降低，而兩組細(xì)胞的EGFR蛋白和mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)升高;但在MDA-MB-231細(xì)胞中HER-2表達(dá)增高但無(wú)明顯差異，僅在T47D中則出現(xiàn)HER-2表達(dá)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.在乳腺癌細(xì)胞中，通過(guò)基因干擾技術(shù)減低BAG-1表達(dá)能夠增強(qiáng)吉非替尼(gefitinib)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，增加乳腺癌細(xì)胞凋亡率和發(fā)生細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而抑