MicroRNA-138-5p對(duì)肺腺癌細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響.pdf

1、目的：本研究旨在尋找Gefitinib耐藥的相關(guān)miRNA，確定其靶基因，為克服Gefitinib獲得性耐藥提供思路。
　　方法：使用miRNA芯片分析Gefitinib敏感的PC9肺腺癌細(xì)胞和誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥的子代PC9GR(gefitinib resistance)細(xì)胞之間miRNA表達(dá)譜的差異，篩選出異常表達(dá)的miRNA。選取差異最顯著的miRNA為主要研究對(duì)象。使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證miRNA芯片的結(jié)果

2、。miRNA mimics轉(zhuǎn)染高表達(dá)miRNA的細(xì)胞，miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染低表達(dá)細(xì)胞，MTS實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞對(duì) Gefitinib的敏感性變化。預(yù)測軟件尋找 miRNA的靶基因，使用qRT-PCR、western blot、免疫組化檢測miRNA與其靶基因的表達(dá)量在細(xì)胞水平和組織水平的關(guān)系。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)證實(shí)miRNA與靶基因直接結(jié)合。在miRNA mimics轉(zhuǎn)染高表達(dá)miRNA的細(xì)胞、miRNA inhib

3、itor轉(zhuǎn)染低表達(dá)miRNA的細(xì)胞后，使用qRT-PCR和western blot檢測miRNA靶基因mRNA和蛋白質(zhì)量的變化。使用小干擾RNA技術(shù)(siRNA)敲低靶基因的蛋白表達(dá)后，使用MTS實(shí)驗(yàn)評(píng)估處理后的細(xì)胞對(duì)Gefitinib敏感性的變化。
　　結(jié)果：同 PC9細(xì)胞相比，miR-138-5p在 PC9GR細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)最明顯。qRT-PCR確認(rèn)miR-138-5p在PC9GR細(xì)胞中表達(dá)降低。使用miR-138-5p mi

4、mics PC9GR和 H1975細(xì)胞后，Gefitinib的敏感性顯著上升。使用 miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染PC9細(xì)胞后，細(xì)胞對(duì)Gefitinib的敏感性無顯著變化。TargetScan and miRanda預(yù)測軟件提示GPR124是miR-138-5p的靶基因。qRT-PCR和western blot的結(jié)果提示，在mRNA水平和蛋白水平上，GPR124的表達(dá)量在PC9GR細(xì)胞中均高于PC9細(xì)胞，與 miR-138

5、-5p的表達(dá)趨勢相反。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)提示miR-138-5p與GPR124的3’-UTR區(qū)直接結(jié)合。qRT-PCR檢測提示與癌旁組織相比，miR-138-5p在肺腺癌組織中低表達(dá)。免疫組化和 qRT-PCR(P<0.05)提示GPR124在肺腺癌組織中高表達(dá)。Pearson檢驗(yàn)提示在組織mRNA水平上，miR-138-5p和GPR124的表達(dá)水平呈負(fù)性相關(guān)。siRNA敲低GPR124的表達(dá)后，PC9GR和H1974細(xì)胞對(duì)Ge