長鏈非編碼RNA GAS5逆轉肺腺癌對吉非替尼耐藥的研究.pdf

1、前言:
　　肺癌是臨床中最常見的惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的15％。非小細胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的85％，肺腺癌又是非小細胞肺癌的主要病理類型之一，預后較差。盡管肺癌的診斷和治療已經有了長足的進步，但進展期的肺癌預后仍然較差，許多病例在診斷時已經處于疾病的晚期，失去了手術機會，而傳統(tǒng)放、化療的治療效果已不明顯。非小細胞肺癌的患者5年生存率僅為5％～10％。
　　吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGF

2、R-TKI)，常用于非小細胞肺癌治療，其機制為通過與ATP或底物競爭性結合胞外的配體結合位點，阻斷EGFR分子內酪氨酸的自身磷酸化和酪氨酸激酶的活化，抑制EGFR激活，阻止下游信號轉導，抑制有絲分裂原活化蛋白激酶的活化，抑制腫瘤血管生成，促進細胞凋亡。該藥物在臨床實踐中取得了顯著療效，然而臨床上有部分患者對EGFR-TKI治療不敏感，或經過一段時間對吉非替尼最終產生耐藥。NSCLC病人酪氨酸激酶區(qū)域的EGFR發(fā)生，其中19號外顯子的框架

3、缺失和21號外顯子上的點突變?yōu)槊舾行酝蛔?。而耐藥突變的機制主要包括原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥，前者包括EGFR耐藥突變、KRAS突變、PTEN表達缺失和上皮間質型轉化;繼發(fā)耐藥機制主要包括T790M突變、VEGF/VEGFR表達變異、MET基因擴增HGF超表達和IGF-1R的過表達。原發(fā)和繼發(fā)耐藥機制并不是相互獨立的，而是有相互交叉作用。因而，研究如何增強腫瘤細胞對吉非替尼的敏感性具有重要的臨床意義。
　　長鏈非編碼RNA(LncRNA)

4、是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，LncRNA在各種疾病中的作用越來越突出，已成為繼MicroRNA之后又一研究熱點。有研究表明LncRNA能增強腫瘤細胞的增殖能力、運動性和侵襲力，并和耐藥相關。GAS5最初作為生長停滯細胞中高表達的基因被發(fā)現(xiàn)。受mTOR蛋白調控并且表達受營養(yǎng)環(huán)境影響。GAS5由于與糖皮質激素受體結構類似，可以通過競爭性抑制糖皮質激素受體與其作用位點的結合抑制糖皮質激素的作用。GAS5在乳腺癌及非小細胞

5、肺癌中低表達，并能抑制腫瘤細胞的生長。且研究表明GAS5能夠影響細胞內EGFR和Mir-21的表達水平，而Mir-21能夠調節(jié)IGF-1R的水平。IGF-1R的過表達又是肺癌細胞對EGFR-TKIs耐藥的重要機制之一，因此我們猜測GAS5可能通過影響Mir-21來降低細胞內IGF-1R的表達，從而逆轉肺腺癌對EGFR-TKIs的耐藥。
　　目前，關于GAS5與肺癌耐藥的關系研究較少。因此，本研究旨在探討在人肺腺癌組織中GAS5的表

6、達情況，并研究其在肺腺癌中與吉非替尼耐藥的關系。
　　方法:
　　1、GAS5在人肺腺癌組織及細胞系中的表達，應用實時定量PCR技術檢測GAS5在人肺腺癌組織和癌旁組織中的表達。應用實時定量PCR技術檢測GAS5在肺腺癌細胞系和支氣管上皮細胞中的表達。
　　2、GAS5聯(lián)合吉非替尼影響肺腺癌細胞系A549的增殖作用，利用脂質體轉染法將GAS5載體及空載體轉染人肺癌A549細胞。利用實時定量PCR方法檢測A549細胞中G

7、AS5的表達檢測是否轉染成功。MTT、平板克隆形成試驗及EdU法檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對A549細胞增殖的影響。應用流式細胞儀檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對A549細胞凋亡作用的影響。通過裸鼠成瘤實驗檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對A549細胞體內成瘤性的影響。
　　3、GAS5聯(lián)合吉非替尼抑制肺腺癌A549細胞增殖的機制。利用Western blot檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對EGFR及其下游通路蛋白的影響。利用Western blot檢

8、測GAS5聯(lián)合吉非替尼對IGF-1R的影響。
　　結果:
　　1、GAS5在肺腺癌組織及細胞系中的表達。實時定量PCR結果顯示GAS5在肺腺癌組織中的表達低于癌旁組織，相對表達量為癌旁組織的0.76(P＜0.05)，且與腫瘤大小、分化程度和臨床分期相關(P＜0.05)。實時定量PCR結果顯示GAS5在四種肺癌細胞系中的表達低于支氣管上皮細胞(P＜0.05)，四種肺癌細胞系，按GAS5的表達水平排序為HCC827＞H1299＞

9、H1975＞A549。
　　2、GAS5聯(lián)合吉非替尼抑制肺腺癌細胞系A549的增殖作用。轉染的載體由吉凱公司合成，經過實時定量PCR檢測經過轉染A549細胞中GAS5的表達量相對與空載體為68倍(P＜0.05)，表明轉染成功。MTT法檢測顯示給藥濃度0.1、1、10、20和40μM/L吉非替尼聯(lián)合GAS5能夠顯著抑制A549細胞的生長(P＜0.05)。平板克隆形成試驗表明GAS5聯(lián)合吉非替尼組克隆形成集落最少，對照組和吉非替尼組最

10、多(P＜0.05)。EdU實驗表明GAS5聯(lián)合吉非替尼組DNA合成明顯受到抑制，合成率顯著低于其余三組(P＜0.05)。流式細胞儀檢測顯示GAS5聯(lián)合吉非替尼顯著促進A549細胞凋亡，高于其余三組(P＜0.05)。裸鼠體內成瘤實驗表明，皮下注射30天后，GAS5聯(lián)合吉非替尼能夠顯著抑制裸鼠體內腫瘤形成，無論是體積還是重量，均低于其余三組(P＜0，05)。
　　3、GAS5增強吉非替尼作用的機制。Western Blot結果示:GA

11、S5聯(lián)合吉非替尼組在濃度為1、5、10μMol/l時EGFR、Akt及ERK的磷酸化水平明顯下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05);相反，在其余三組內，EGFR、Akt及ERK的磷酸化水平下降不明顯。Western Blot結果顯示:GAS5聯(lián)合吉非替尼組中IGF-1R磷酸化水平明顯下降，呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05);其余三組下降不明顯。
　　結論:
　　1、肺腺癌組織中GAS5表達顯著低于癌旁正常組織，并且與腫瘤大小、分