吉非替尼通過自噬促進人肺腺癌PC-9細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、自噬是一個普遍存在于真核細胞且高度保守的代謝過程,它是細胞自我更新,組織器官發(fā)育和分化的重要調(diào)節(jié)機制。大量研究表明腫瘤細胞在缺氧、營養(yǎng)缺乏、細胞器受損等刺激下可以發(fā)生自噬。適度的自噬可以維持腫瘤細胞物質(zhì)代謝和能量供給,保護腫瘤細胞在不利環(huán)境中繼續(xù)生存,而過度自噬則導致重要蛋白質(zhì)和細胞器受損,細胞進而發(fā)生凋亡或者壞死。由此可見自噬對于腫瘤細胞是一把雙刃劍,其最終作用可能與腫瘤細胞組織來源和受到的刺激因素有關。調(diào)控細胞自噬,發(fā)揮自噬殺傷腫瘤

2、細胞作用可能用于腫瘤個體化治療。本實驗以EGFR突變型人肺腺癌PC-9細胞為研究對象,觀察EGFR分子靶向藥物吉非替尼(Gefitinib)誘導PC-9細胞凋亡和自噬的作用及相關機制。
　　第一部分:通過MTT實驗測定PC-9細胞Gefitinib IC50;Annexin V-FITC/PI雙重染色和流式細胞術(shù)檢測Gefitinib誘導PC-9細胞凋亡的作用。
　　第二部分:綜合采用形態(tài)學和分子生物學研究手段,觀察Gefi

3、tinib誘導PC-9細胞自噬的作用。吖啶橙(AO)染色發(fā)現(xiàn)PC-9細胞經(jīng)Gefitinib處理后,細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染的嗜酸性自噬囊泡(AVOs);細胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,激光共聚焦顯微鏡下可見Gefitinib處理后細胞內(nèi)綠色熒光點狀聚集;透射電鏡下可以觀察到典型自噬小體,確定Gefitinib可以誘發(fā)PC-9細胞自噬。Western blot檢測自噬標記物LC3表達,結(jié)果顯示Gefitinib促進LC3 I→LC3 II轉(zhuǎn)化,升

4、高LC3-II/I比值。
　　第三部分:主要進行Gefitinib誘發(fā)PC-9細胞自噬的功能研究。使用自噬強效誘導劑雷帕霉素(Rapamycin)聯(lián)合Gefitinib處理PC-9細胞,細胞凋亡率明顯增加,p-mTOR和p-Akt表達進一步受到抑制;使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻斷Gefitinib誘導的細胞自噬,PC-9細胞凋亡率較Gefitinib單藥處理組減少,p-mTOR和p-Akt不能被有效抑制;說明Gefi