FOXM1-MET正反饋環(huán)路促進肺腺癌細胞吉非替尼耐藥的機制研究.pdf

1、吉非替尼耐藥限制了其臨床應用，其機制丞待進一步研究。近四分之一的EGFR-TKI耐藥患者被檢出 MET基因擴增。MET基因擴增已被證實是通過修復由ERBB3反式激活介導的PI3K/AKT等信號通路來獲得吉非替尼耐藥，是吉非替尼耐藥的重要機制。PI3K/AKT信號通路在肺癌細胞中常常過度激活，并與肺癌的演進和EGFR-TKI耐藥密切相關。近期幾項研究表明，與細胞增殖密切相關的促癌轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在腫瘤細胞吉非替尼耐藥中發(fā)揮了重要作用，但

2、具體的分子機制尚不十分明確。此外，有研究表明FOXM1受PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié)。本課題調(diào)查了FOXM1在肺腺癌吉非替尼耐藥中的作用，并發(fā)現(xiàn)FOXM1和MET/AKT信號通路存在相互調(diào)節(jié)的分子機制。FOXM1在肺腺癌細胞中能與MET DNA啟動子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控 MET，MET也能在肺腺癌細胞中通過激活 PI3K/AKT信號通路調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子FOXM1。FOXM1與MET信號通路相互調(diào)節(jié)并形成一個正反饋環(huán)路促進肺腺癌細胞吉非替

3、尼耐藥。還發(fā)現(xiàn)FOXM1、MET和pAKT在肺腺癌組織中的表達遠高于正常肺組織，且這三個分子在肺腺癌組織中的表達正相關。本課題不但闡明了FOXM1與MET/AKT信號通路在肺腺癌細胞中相互調(diào)節(jié)的分子機制，也為FOXM1作為肺腺癌治療靶點提供更為豐富的理論基礎。
　　第一部分FOXM1促進肺腺癌細胞吉非替尼耐藥的作用研究
　　為建立肺腺癌吉非替尼耐藥細胞系，采用逐漸增加細胞培養(yǎng)基吉非替尼濃度的方法誘導耐藥細胞的產(chǎn)生，6個月后成

4、功建立了吉非替尼耐藥細胞系PC9/GR和HCC827/GR。MTT檢測結(jié)果顯示，上調(diào)FOXM1能顯著增強PC9和HCC827細胞的吉非替尼耐藥能力，而下調(diào)FOXM1能顯著降低PC9/GR和HCC827/GR細胞的吉非替尼耐藥能力。EdU檢測結(jié)果顯示，上調(diào)FOXM1使吉非替尼作用后的EdU陽性細胞明顯增多，而下調(diào)FOXM1使吉非替尼作用后的EdU陽性細胞明顯減少。此外，上調(diào)FOXM1能明顯抑制吉非替尼對PC9和HCC827細胞的凋亡和G1

5、期阻滯作用，而下調(diào)FOXM1能明顯促進吉非替尼對PC9/GR和HCC827/GR細胞的凋亡和G1期阻滯作用。這些結(jié)果說明 FOXM1在肺腺癌吉非替尼耐藥中發(fā)揮了重要作用，能減弱吉非替尼對肺腺癌細胞的凋亡和G1期阻滯作用。
　　第二部分FOXM1在肺腺癌細胞中激活MET/AKT信號通路的機制研究
　　采用蛋白質(zhì)免疫印跡法和實時熒光定量 PCR法在蛋白和 mRNA水平觀察FOXM1和相關分子在肺腺癌細胞中的表達。我們發(fā)現(xiàn)FOXM

6、1、pMET、MET和pAKT在肺腺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/GR和HCC827/GR中的表達遠高于其親代細胞系PC9和HCC827。此外，在PC9/GR和HCC827/GR細胞中下調(diào)FOXM1能顯著降低FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達水平，且能降低MET的mRNA表達水平。在PC9和HCC827細胞中上調(diào)FOXM1能顯著升高FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達水平，且能升高 MET的 mRNA表達水平，但

7、 MET抑制劑PHA-665752具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。為進一步明確FOXM1調(diào)控MET的分子機制，采用ChIP結(jié)合PCR的方法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在肺腺癌細胞PC9和HCC827中能與MET的DNA啟動子結(jié)合。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1在肺腺癌細胞PC9和HCC827中能顯著增強MET的DNA啟動子活性。通過荷瘤小鼠模型，在體內(nèi)進一步驗證了FOXM1促進肺腺癌細胞吉非替尼耐藥的作用以及對MET信號通路的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果

8、說明 FOXM1在肺腺癌細胞中能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MET，并調(diào)控其下游AKT信號通路。
　　第三部分MET在肺腺癌細胞中激活AKT/FOXM1信號通路的機制研究
　　為進一步明確FOXM1和MET信號通路的調(diào)控關系，在肺腺癌細胞中檢測了 MET/AKT信號通路對 FOXM1的作用。在 PC9/GR和 HCC827/GR細胞中下調(diào)MET能顯著降低FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達水平，且能降低FOXM1的mRNA表達

9、水平。在PC9和HCC827細胞中上調(diào)MET能顯著升高FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達水平，且能升高FOXM1的mRNA表達水平，但AKT抑制劑LY294002具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)FOXM1、MET和pAKT在肺腺癌組織中的表達水平遠高于相應的癌旁正常肺組織，且這三個分子在肺腺癌組織中的表達正相關。這些結(jié)果說明 MET/AKT信號通路在肺腺癌細胞中能調(diào)控FOXM1，F(xiàn)OXM1與MET/AKT信號通路相互調(diào)