PIK3R3-STAT3正反饋環(huán)路在Trastuzumab耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分 PIK3R3促進HER2陽性乳腺癌及胃癌Trastuzumab耐藥的研究
　　目的：研究PIK3R3在HER2陽性乳腺癌和胃癌的Trastuzumab耐藥中作用。
　　方法：首先，我們利用在線數(shù)據(jù)庫，包括癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）,分析 PIK3R3與乳腺癌、胃癌的臨床病理關(guān)系。然后，通過對Trastuzumab敏感乳腺癌細胞系（BT474, SKBR3）和胃癌細胞

2、系（NCI-N87）進行長時間（6個月）的Trastuzumab處理，分別得到對 Trastuzumab耐藥的細胞系（BT474-R, SKBR3-R, NCI-N87-R）。分析Trastuzumab敏感細胞系及耐藥細胞系中PIK3R3的表達情況。進一步在Trastuzumab敏感細胞系中高表達PIK3R3，在體外以及體內(nèi)實驗中觀察PIK3R3對Trastuzumab耐藥的影響。最后，在Trastuzumab耐藥細胞系中低表達PIK3

3、R3，觀察PIK3R3對Trastuzumab耐藥的影響。
　　結(jié)果：第一，PIK3R3在HER2陽性乳腺癌患者中，PIK3R3的表達水平與患者預(yù)后以及無瘤生存期相關(guān)。第二，在Trastuzumab耐藥細胞系中PIK3R3水平相比對應(yīng)敏感細胞系高。第三，Trastuzumab敏感細胞系高表達PIK3R3后，對Trastuzumab敏感性降低。第四，Trastuzumab耐藥細胞系低表達PIK3R3后，能恢復(fù)對Trastuzumab

4、治療的反應(yīng)。
　　結(jié)論：PIK3R3表達水平與HER2陽性乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)。PIK3R3在Trastuzumab耐藥患者以及細胞系中均高表達。PIK3R3高表達能促進 Trastuzumab耐藥。而在Trastuzumab耐藥細胞系中，低表達PIK3R3能恢復(fù)Trastuzumab敏感性。
　　第二部分 PIK3R3促進Trastuzumab耐藥的機制研究
　　目的：研究PIK3R3在HER2陽性乳腺癌和胃癌中促進T

5、rastuzumab耐藥的具體機制。方法：首先，在Trastuzumab敏感細胞系中高表達PIK3R3以及在Trastuzumab耐藥細胞系低表達PIK3R3，檢測其耐藥相關(guān)下游信號通路（AKT和STAT3）的變化。并且在體外實驗中高表達PIK3R3的同時通過特異性抑制劑或者特異性siRNA阻遏下游信號通路，觀察相關(guān)信號通路對PIK3R3促Trastuzumab耐藥的影響。然后，在體內(nèi)實驗中，高表達 PIK3R3同時加入相關(guān)信號通路的抑

6、制劑治療，觀察加入抑制劑后對Trastuzumab治療的影響。
　　結(jié)果：第一，高表達PIK3R3或者低表達后，發(fā)現(xiàn)對AKT磷酸化水平并無明顯影響，說明PIK3R3不能通過經(jīng)典PI3K-AKT通路影響Trastuzumab耐藥，但是發(fā)現(xiàn)PIK3R3能明顯影響STAT3的磷酸化水平。第二，高表達PIK3R3能激活I(lǐng)L-6/STAT3炎性環(huán)路。第三，在體外和體內(nèi)實驗中，高表達 PIK3R3后加入 STAT3抑制劑或者 STAT3的特異

7、性siRNA，能明顯消除PIK3R3引起的耐藥效應(yīng)。第四，PIK3R3能通過STAT3激活ERK信號通路，從而促進Trastuzumab耐藥。
　　結(jié)論：PIK3R3通過STAT3而不是AKT通路引起Trastuzumab耐藥，抑制STAT3通路能消除PIK3R3引起的耐藥效應(yīng)。
　　第三部分 PIK3R3與STAT3形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路
　　目的：明確PIK3R3激活STAT3的具體機制和PIK3R3與STAT3之間的

8、關(guān)系。
　　方法：首先，通過免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，IP）、免疫熒光共定位（Immunofluorescence colocalization，IFC）等方法探討PIK3R3與STAT3之間的關(guān)系。然后，用STAT3特異性小分子抑制STAT3活性，或者用siRNA低表達STAT3，檢測PIK3R3表達的變化。再構(gòu)建含PIK3R3啟動子區(qū)域的報告基因，明確STAT3的活性對于 PIK3R3啟動子活性

9、的影響。最后，利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）明確 STAT3能直接作用于 PIK3R3啟動子區(qū)域而調(diào)控PIK3R3的表達。
　　結(jié)果：第一，PIK3R3能與STAT3直接結(jié)合，從而磷酸化STAT3而激活STAT3。第二，抑制STAT3活性，PIK3R3的mRNA水平和蛋白水平均下降，并且激活STAT3能促進PIK3R3啟動子活性。第三，活化的STAT3能直接結(jié)合在PI