miR-126靶向PIK3R2調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞及在靜脈血栓再通中的作用研究.pdf

1、目的:研究miR-126調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞及對(duì)靜脈血栓溶解、機(jī)化和再通的影響,為慢性深靜脈血栓的治療提供一種新的治療思路。
　　方法:首先分離、培養(yǎng)及鑒定骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞,將miR-126模擬物、抑制劑或陰性對(duì)照物用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮祖細(xì)胞中,采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-126對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響;采用劃痕實(shí)驗(yàn)、穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-126對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響;采用matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-

2、126對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞成小管能力的影響。進(jìn)一步預(yù)測(cè)miR-126靶基因PIK3R2,并構(gòu)建包含野生型PIK3R23’UTR和突變體PIK3R23’UTR的Luciferase報(bào)告基因載體,檢測(cè)miR-126對(duì)PIK3R2的直接調(diào)控作用,Western blot分析PIK3R2蛋白以及PI3K/AKT信號(hào)通路中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的變化。再構(gòu)建miR-126慢病毒表達(dá)載體(pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126),H

3、EK293T細(xì)胞包裝、重組、擴(kuò)增慢病毒顆粒,熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá), PCR、雙酶切、基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126的表達(dá)。然后結(jié)扎大鼠腎下段下腔靜脈建立深靜脈血栓模型,將慢病毒轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植到靜脈血栓模型中。分為三組:A組(12只),空白對(duì)照組,經(jīng)尾靜脈注射1ml PBS;B組(12只),EP

4、Cs/pLVX-IRES-ZsGreen Vector(EPCs/vector),經(jīng)尾靜脈注入含有1.0×106EPCs/vector的PBS細(xì)胞懸液。C組(12只), EPCs/pLVX-IRES-ZsGreen-miR-126(EPCs/miR-126),經(jīng)尾靜脈注入含有1.0×106EPCs/miR-126的PBS細(xì)胞懸液。移植后7天、14天取出血栓段下腔靜脈及血栓,通過稱重評(píng)價(jià)血栓溶解情況,熒光示蹤觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢到靜脈血栓情

5、況, HE染色評(píng)價(jià)靜脈血栓機(jī)化及CD34免疫組化觀察血栓再通變化。采用SPSS15.0軟件進(jìn)行分析,P<0.05為差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)、鑒定了大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞。電轉(zhuǎn)成功后,miR-126對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞早期具有促進(jìn)增殖及改變細(xì)胞周期的作用,后期沒有影響。劃痕實(shí)驗(yàn)及穿膜實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了miR-126模擬物能夠顯著促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力;miR-126抑制劑則能抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。miR-126模擬物

6、可以增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的成小管能力,miR-126抑制劑能抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的成小管能力。野生型PIK3R23’UTR和突變體PIK3R23’UTR的Luciferase報(bào)告基因載體構(gòu)建及鑒定成功,共轉(zhuǎn)染miR-126模擬物和pMIR/PIK3R2報(bào)告基因載體后,螢光素酶活性明顯降低,而共轉(zhuǎn)染miR-126抑制劑和pMIR/PIK3R2報(bào)告基因載體后,螢光素酶活性變化不大,共轉(zhuǎn)染miR-126模擬物或抑制劑和pMIR/PIK3R2/mut報(bào)告基

7、因載體后則不影響信號(hào)強(qiáng)度。上調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平后,其PIK3R2蛋白表達(dá)水平明顯下降,PI3K和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白表達(dá)上調(diào),而下調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平后,其PIK3R2蛋白表達(dá)水平明顯增加,PI3K和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白表達(dá)下調(diào)。經(jīng)酶切及測(cè)序結(jié)果提示慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126構(gòu)建正確,能有效轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞,轉(zhuǎn)染 miR-126后在內(nèi)皮祖細(xì)胞

8、的表達(dá)較對(duì)照組高216倍。內(nèi)皮祖細(xì)胞被移植到靜脈血栓后,在7天和14天兩個(gè)時(shí)間段內(nèi),EPCs/miR-126組中靜脈血栓的重量最低,螢光陽性細(xì)胞數(shù)目最多,HE染色和CD34免疫組化提示更能促進(jìn)血栓的機(jī)化和再通,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:miR-126能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管能力,包括增殖、遷移和成小管能力,miR-126能夠負(fù)性調(diào)控其靶基因PIK3R2,激活PI3K/AKT信號(hào)通路。上調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞的miR-126表達(dá)后能夠促進(jìn)靜