microRNA126調控內皮祖細胞多向分化的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　內皮祖細胞(EPCs)在血管內皮受損時，由骨髓動員至外周血，可分化為新生單層內皮細胞，進而修復損傷的內皮。但多項研究發(fā)現(xiàn)EPCs能發(fā)生內皮-間質轉化(EndMT):在TGF-β1的誘導下，失去KDR+、CD34+、VEGF等血管內皮分子標記，轉而表達α-SMA、SM22α、myocardin等間質細胞標記物，使EPCs在治療動脈粥樣硬化性疾病中的價值受到質疑。
　　microRNA126(miR-126)是

2、在內皮細胞特異性表達的一種促血管新生microRNA。miR-126能促進EPCs的動員、遷移、增殖，不影響EPCs的內皮分化，但miR-126對EPCs問質轉化的影響國內外未見報道。
　　本研究擬觀察miR-126對EPCs間質轉化的影響及其調節(jié)機制，為EPCs在動脈粥樣硬化治療中的作用進一步提供理論基礎。
　　方法：
　　采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細胞后通過離體擴增培養(yǎng)法獲得骨髓源EPCs。于倒置相差顯微

3、鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。免疫熒光、流式細胞術及乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)和FITC標記的荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)雙熒光染色等方法鑒定EPCs純度。TGF-β1（5 ng/ml培養(yǎng)基）作用EPCs7天誘導EPCs的間質轉化(EndMT)。慢病毒轉染建立miR-126過表達EPCs。采用MTT方法檢測細胞活力;細胞損傷及Transwell方法檢測細胞遷移能力。慢病毒轉染建立PIK3R2基因的沉默及過表達EPC

4、s。通過熒光素酶報告系統(tǒng)確定PIK3R2是否為miR-126靶基因。FoxO3 shRNA慢病毒轉染沉默F(xiàn)oxO3基因。采用Real-time PCR檢測間質轉錄因子mRNA表達水平。采用Western-blot檢測信號分子蛋白表達。研究miR-126對EPCs EndMT的影響及其調節(jié)機制。
　　結果：
　　1、TGF-β1可成功誘導EPCs EndMT，其miR-126表達逐漸降低，呈時間依賴性。miR-126過表達不影

5、響EPCs的生長，但抑制間質轉化后EPCs的增殖與遷移。
　　2、miR-126抑制EPCs間質細胞標記物（α-SMA、SM22α、 myocardin）及間質轉錄因子(slug、snail、zeb1、endothelin-1)的表達，維持EPCs祖細胞標記(CD34、CD31、CD133、KDR)及成熟內皮細胞標記物（VEGF、eNOS、iNOS、Flt-1）的表達。
　　3、熒光素酶質粒報告系統(tǒng)確定PIK3R2在EPCs

6、內為miR-126的一個靶基因。PIK3R2 shRNA能抑制EPCs向間質細胞形態(tài)轉變及間質標記物(α-SMA、SM22α)的表達。
　　4、miR-126抑制EPCs內SM22α的表達;PIK3R2 cDNA轉染可增加EPCs胞漿內PIK3R2的表達，同時能逆轉miR-126對TGFβ1作用下EPCs胞漿內PIK3R2及SM22α表達的抑制。
　　5、EPCs問質轉化后細胞PI3K、p-Akt、p-FoxO3表達降低，而

7、Smad3、p-Smad3和Smad4表達無明顯變化，PIK3R2 shRNA抑制EPCs內信號分子這種表達，PI3K抑制劑LY294002能逆轉PIK3R2 shRNA的作用。
　　6、通過IGF-1激活PI3K/Akt通路，能明顯增加EPCs內p-FoxO3的表達，并抑制TGF-β1誘導的SM22α的表達。但對Smad3、p-Smad和Smad4表達無影響。
　　7、miR-126過表達能促進PI3K、p-Akt、p-F

8、oxO3的表達，對p-Smad3、Smad4表達無明顯影響，并被PIK3R2 cDNA所逆轉。EPCs間質轉化后Smad4，F(xiàn)oxO3核表達增多，miR-126抑制TGF-β1誘導下EPCs核內Smad4和FoxO3的表達。
　　8、TGF-β1誘導EPCs間質轉化后細胞p-FoxO3表達明顯降低，F(xiàn)oxO3 shRNA抑制EPCs中FoxO3的表達;同時，F(xiàn)oxO3 shRNA抑制TGF-β1誘導的SM22α表達。
　　結