誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的建系及其體外向內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞定向分化的實驗研究.pdf

1、高效制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，并研究其向內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的定向分化能力，對組織工程中種子細(xì)胞的研究具有重要意義。本研究目的是探討以磁性納米粒子為基因載體的技術(shù)，高效制備iPs細(xì)胞并建系。進(jìn)一步進(jìn)行體外iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的實驗研究。
　　 實驗方法如下：
　　 1.以第5代PAMAM樹形分子修飾磁性納米粒子作為基因轉(zhuǎn)染載體，將4種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Nanog、Lin28，連

2、同包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜蛋白質(zhì)粒PMD2.G，共同傳染293T細(xì)胞，將所獲得的含有4種基因的慢病毒和人成纖維細(xì)胞在37℃下共同孵育，直至產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)樣細(xì)胞克隆。同樣的方法，以脂質(zhì)體為基因載體，作為對照組，比較兩種載體在轉(zhuǎn)載后生成的慢病毒滴度。
　　 2.ES樣細(xì)胞克隆通過形態(tài)學(xué)、免疫熒光染色法、核型分析、類胚體及畸胎瘤形成等鑒定，證明iPS細(xì)胞的成功建系。
　　 3.改良傳統(tǒng)ES細(xì)胞與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)的

3、誘導(dǎo)方式，運(yùn)用OP9細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，進(jìn)行EB細(xì)胞懸浮法培養(yǎng)，在FLK1大量表達(dá)時，進(jìn)行體外向內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的定向分化。
　　 結(jié)果顯示，樹形分子修飾的磁性納米粒子能夠?qū)⑷?種基因轉(zhuǎn)載進(jìn)入293T。細(xì)胞，所獲得的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入人成纖維細(xì)胞，生成iPS細(xì)胞。其生成的慢病毒的滴度，為對照組脂質(zhì)體轉(zhuǎn)載生成慢病毒的10倍。免疫熒光、核型分析以及類胚體與畸胎瘤形成，顯示iPS細(xì)胞具備多向分化潛能。并運(yùn)用自創(chuàng)的OP9細(xì)胞條件培養(yǎng)液