人骨髓來源的多能成體祖細胞在體外定向誘導分化為肝樣細胞的實驗研究.pdf

1、第一部分:人骨髓來源的多能成體祖細胞分離純化及體外培養(yǎng)的實驗研究 目的:建立體外分選純化人MAPCs的方法,用自行配制的細胞培養(yǎng)基對MAPCs進行體外培養(yǎng),了解其生長、增殖特性.方法:取志愿者適量骨髓后采用梯度密度離心法分離獲取單個核細胞,對單個核細胞行貼壁培養(yǎng)后,將獲取的骨髓貼壁細胞通過CD45、GlyA免疫微磁珠負分選,流式細胞儀鑒定分選后細胞純度;培養(yǎng)觀察細胞生長情況,對傳代到不同階段的細胞進行CD45、GlyA流式細胞分析,初步

2、了解MAPCs在培養(yǎng)、增殖過程中的免疫學穩(wěn)定性.結(jié)論:(1)CD45、GlyA免疫微磁珠負分選可從骨髓中分離高純度的MAPCs;(2)MAPCs在體外有較強的增殖能力,且能保持較長時間的穩(wěn)定狀態(tài);(3)我們自行研制的人MAPCs培養(yǎng)基能成功體外培養(yǎng)MAPCs.第二部分:人骨髓來源的多能成體祖細胞在不同誘導條件下向肝樣細胞分化的實驗研究 目的:探索人骨髓來源MAPCs在不同條件下誘導分化為肝細胞的可行性;摸索并確立骨髓MAPCs誘導為肝細

3、胞的適當培養(yǎng)方法及條件,建立一個獲得"骨髓源MAPCs"的成熟技術平臺,為其在組織工程學研究和臨床醫(yī)學中的廣泛應用奠定基礎.方法:(1)分組:A組:HGF(20ng/ml)、B組:FGF-4(10ng/ml)、C組:HGF(20ng/ml)+FGF-4(10ng/ml)、D組:24小時70％肝葉切除兔門靜脈血清(RPVS,10%濃度)誘導分化MAPCs,E組(陽性對照組):L-02人肝細胞株、F組(陰性對照組):未加任何誘導因素的MAP

4、Cs;(2)免疫細胞化學、免疫熒光化學鑒定各組不同誘導分化階段細胞的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝細胞特征的表型變化并計數(shù)陽性細胞比率;(3)RT-PCR檢測A、B、C組不同誘導分化階段細胞的ALB、AFP、CK-18、CK-19的mRNA轉(zhuǎn)錄;(4)Western blot檢測B、C組誘導分化第21天、35天后細胞的ALB的表達.結(jié)論:(1)人骨髓來源的MAPCs具有向肝樣細胞分化的潛能;(2)HGF及FGF-4具有誘導人