小鼠多能成體祖細(xì)胞的培養(yǎng)及冷凍保存.pdf

1、第一部分 BALB/c小鼠多能成體祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　 目的：建立獲得大量BALB/c小鼠多能成體祖細(xì)胞（MAPC）的細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法，為下一步獲得純化的MAPC奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：從BALB/c小鼠脛骨和股骨中分離得到骨髓細(xì)胞懸液，采用全骨髓差異貼壁法，在含EGF、PDGF、LIF和低血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2周后以一定比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，將不同時(shí)期細(xì)胞進(jìn)行Giemsa染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)MTT比色法比較不

2、同周齡小鼠、原代接種密度和傳代接種密度對(duì)原代MAPC生長(zhǎng)的影響。
　　 結(jié)果：取材自3周小鼠所獲得原代細(xì)胞均一性和增殖情況最好，原代接種密度在（6～12）×105/cm2，傳代接種密度在（20-30）×103/cm2最有利于原代 MAPC的生長(zhǎng)。Giemsa染色可見梭形和三角形細(xì)胞。
　　 結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，BALB/c小鼠的原代MAPC能較穩(wěn)定生長(zhǎng)和擴(kuò)增，給后續(xù)MACS分選提供了大量的細(xì)胞來(lái)源。
　　 關(guān)第

3、二部分 BALB/c小鼠多能成體祖細(xì)胞的純化和擴(kuò)增
　　 目的：獲得純化的MAPC并探索MAPC體外穩(wěn)定傳代擴(kuò)增的培養(yǎng)條件，建立MAPC細(xì)胞系，為探索MAPC向生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化潛能打下基礎(chǔ)。
　　 方法：取傳2代的骨髓細(xì)胞，磁珠陰性分選去除CD45+和Ter119+細(xì)胞，將所獲目的細(xì)胞以一定密度接種，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并繪制MAPC生長(zhǎng)曲線。臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)MACS分選前后細(xì)胞活力有無(wú)差異，MTT比色法比較不同接種密度對(duì)MA

4、PC生長(zhǎng)的影響。
　　 結(jié)果：MACS分選前后細(xì)胞活性無(wú)顯著性差異（P﹥0.05），MAPC的最適接種密度為（6-10）×103/cm2，MAPC接種后1-2天處于生長(zhǎng)停滯期，第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，約持續(xù)3天，以后進(jìn)入平臺(tái)期。分選后MAPC核大，胞質(zhì)少，呈梭形或三角形。
　　 結(jié)論：MACS陰性分選能獲得相對(duì)單一并具有良好增殖活性的MAPC。
　　 第三部分 BALB/c小鼠多能成體祖細(xì)胞的鑒定和冷凍保存

5、　　 目的：鑒定本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的MAPC，并對(duì)MAPC的冷凍保存方法的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)提供足夠的細(xì)胞來(lái)源。
　　 方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MAPC表面標(biāo)記CD 13、CD44和CD34的表達(dá)情況。采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法對(duì)MAPC進(jìn)行冷凍保存，對(duì)溫度稍作調(diào)整，比較凍存前后細(xì)胞活力。
　　 結(jié)果：MAPC表面CD13+、CD44-和CD34-。細(xì)胞凍存前后活力無(wú)顯著性差異（P﹥0.05）。
　　 結(jié)論：全骨髓貼壁