小鼠多能成體祖細胞的培養(yǎng)及冷凍保存.pdf

1、第一部分 BALB/c小鼠多能成體祖細胞的分離培養(yǎng)
　　 目的：建立獲得大量BALB/c小鼠多能成體祖細胞（MAPC）的細胞分離和原代培養(yǎng)方法，為下一步獲得純化的MAPC奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：從BALB/c小鼠脛骨和股骨中分離得到骨髓細胞懸液，采用全骨髓差異貼壁法，在含EGF、PDGF、LIF和低血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2周后以一定比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，將不同時期細胞進行Giemsa染色，觀察細胞形態(tài)，通過MTT比色法比較不

2、同周齡小鼠、原代接種密度和傳代接種密度對原代MAPC生長的影響。
　　 結(jié)果：取材自3周小鼠所獲得原代細胞均一性和增殖情況最好，原代接種密度在（6～12）×105/cm2，傳代接種密度在（20-30）×103/cm2最有利于原代 MAPC的生長。Giemsa染色可見梭形和三角形細胞。
　　 結(jié)論：在本實驗條件下，BALB/c小鼠的原代MAPC能較穩(wěn)定生長和擴增，給后續(xù)MACS分選提供了大量的細胞來源。
　　 關(guān)第

3、二部分 BALB/c小鼠多能成體祖細胞的純化和擴增
　　 目的：獲得純化的MAPC并探索MAPC體外穩(wěn)定傳代擴增的培養(yǎng)條件，建立MAPC細胞系，為探索MAPC向生殖細胞的誘導分化潛能打下基礎(chǔ)。
　　 方法：取傳2代的骨髓細胞，磁珠陰性分選去除CD45+和Ter119+細胞，將所獲目的細胞以一定密度接種，觀察細胞生長情況，并繪制MAPC生長曲線。臺盼藍檢測MACS分選前后細胞活力有無差異，MTT比色法比較不同接種密度對MA

4、PC生長的影響。
　　 結(jié)果：MACS分選前后細胞活性無顯著性差異（P﹥0.05），MAPC的最適接種密度為（6-10）×103/cm2，MAPC接種后1-2天處于生長停滯期，第3天進入對數(shù)增長期，約持續(xù)3天，以后進入平臺期。分選后MAPC核大，胞質(zhì)少，呈梭形或三角形。
　　 結(jié)論：MACS陰性分選能獲得相對單一并具有良好增殖活性的MAPC。
　　 第三部分 BALB/c小鼠多能成體祖細胞的鑒定和冷凍保存

5、　　 目的：鑒定本實驗培養(yǎng)的MAPC，并對MAPC的冷凍保存方法的效果進行了評價，為誘導分化實驗提供足夠的細胞來源。
　　 方法：流式細胞術(shù)檢測MAPC表面標記CD 13、CD44和CD34的表達情況。采用文獻報道的方法對MAPC進行冷凍保存，對溫度稍作調(diào)整，比較凍存前后細胞活力。
　　 結(jié)果：MAPC表面CD13+、CD44-和CD34-。細胞凍存前后活力無顯著性差異（P﹥0.05）。
　　 結(jié)論：全骨髓貼壁