小鼠卵巢組織冷凍保存及卵泡體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、目的：在本研究中我們應用小鼠作為動物模型，研究不同的冷凍保護劑對于卵巢組織冷凍的效果，并研究冷凍后小鼠的竇前卵泡體外生長發(fā)育及不同的培養(yǎng)成分對于卵泡體外發(fā)育的影響，以期能夠找到較好卵巢組織冷凍及卵泡體外成熟的方案，為人類卵巢組織的冷凍選擇合適的冷凍保護劑及體外培養(yǎng)系統(tǒng)，從而為建立人卵巢組織庫提供依據(jù)。 材料與方法： 1．研究對象為4周齡雌性昆明小白鼠60只，由河南省實驗動物中心提供。小鼠飼養(yǎng)暗周期14小時，光照10小時，

2、自由取水和飲食。 2.切除小鼠雙側(cè)卵巢，在顯微鏡下分割成1×1×1-2mm的小塊。放入1.5M的DMSO、PROH、EG的冷凍保護劑中，分別應用一步法和三步法進行平衡，裝入冷凍管后直接投入液氮中。解凍時在37℃的水中復溫5min，放入解凍液中置換出冷凍保護劑，放入培養(yǎng)箱平衡30min。 3. 應用不同的方法分離組織塊中的竇前卵泡，機械分離法將卵巢剪碎吹打后直接用針頭分離；酶分離法為應用0.1﹪的膠原酶消化20min后揀出

3、卵泡；機械+酶分離法為先用酶消化10min，然后再機械分離卵泡。 4.體外卵泡培養(yǎng)液分為4種，基礎培養(yǎng)液：10﹪SPS+10μg/ml胰島素+5.5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+6.7 ng/ml硒(1﹪ITS)+100mIU/mlFSH+α-MEM液；EGF組：基礎培養(yǎng)液+0.05mg/mlEGF；GDF-9組：基礎培養(yǎng)液+100μg/mlGDF-9；EGF+GDF-9組：基礎培養(yǎng)液+0.05mg/mlEGF+100μg/ml GDF-

4、9：對照組為在基礎培養(yǎng)液中培養(yǎng)的新鮮卵泡。將形態(tài)正常卵泡放入不同的培養(yǎng)液做成的微滴中，每個微滴放入2-4個卵泡進行體外培養(yǎng)12天，隔天將微滴中的液體一半換成新鮮的液體。換液時在顯微鏡下觀察卵泡生長情況并測量卵泡直徑。 5. 在第12天將微滴中的液體換為體外成熟液，培養(yǎng)15h后，觀察OCC排出及GVBD情況，去除顆粒細胞，收集成熟卵子。 6. 統(tǒng)計方法：采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。均數(shù)的比較應用

5、t檢驗，率的比較應用X<'2>檢驗。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)或百分率表示，以α=0.05為檢驗水準。 結果： 1、不同平衡方案對卵巢組織形態(tài)學的影響一步平衡組的正常形態(tài)卵泡率(43.5﹪)和竇前卵泡率(43.8﹪)明顯低于對照組(82.1﹪，76.7﹪)和三步平衡組(74.1﹪，72.9)，P<0.01。 2、不同組別卵巢組織中各級卵泡的構成比例各組中竇前卵泡均占較大的比例。對照組的初級卵泡、次級卵泡、竇

6、前卵泡及竇卵泡所占比例分別為5.6﹪、8.3﹪、83.3﹪、2.8﹪，各組相比較，各級卵泡的構成比均無統(tǒng)計學意義，P>0.05。 3．、不同冷凍保護劑對卵巢組織形態(tài)學的影響冷凍復蘇后的卵巢組織部分卵泡發(fā)生閉鎖，卵泡失去正常的圓形結構，卵泡膜完整性遭到破壞；有些卵泡雖然保持正常的形態(tài)，卵泡膜完整，但是卵子出現(xiàn)空泡或發(fā)生皺縮；另外有分離出的結構正常的卵泡在倒置顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)卵子變暗。這種現(xiàn)象在新鮮的卵巢組織中則較少見。 與對照組

7、比較，DMSO組和PROH組正常形態(tài)卵子率明顯低于對照組P<0.01；EG組的正常形態(tài)卵泡率和竇前卵泡率低于對照組，P<0.05，正常形態(tài)卵子率明顯低于對照組，P<0.01。冷凍組間兩兩比較，EG組的正常形態(tài)卵子率低于DMSO組，P<0.05，與PROH組間無明顯差異，P>0.05。 4、不同冷凍保護劑對卵泡體外發(fā)育的影響與對照組比較，各冷凍組的D4天存活率及卵泡直徑的增幅均低于對照組,P<0.05，三組冷凍組間兩兩比較均無明顯

8、差異，P>0.05。 5、不同的分離方法對卵泡數(shù)量及卵泡質(zhì)量的影響酶分離法和酶+機械分離法分離得到的卵泡明顯高于機械分離法，P<0.01，酶分離法所得到的正常卵泡率明顯低于其他兩組，P<0.01。 6、小鼠竇前卵泡體外生長情況培養(yǎng)第2～3天，卵泡貼壁，不能移動；第4天顆粒細胞數(shù)目明顯增多；第5～6天顆粒細胞層增多，顆粒細胞明顯越過基底膜生長，難以清晰觀察卵母細胞；卵泡逐漸失去球形的三維結構；第7～10天，卵泡出現(xiàn)竇腔樣結

9、構；第13天，卵丘逸出；去掉卵丘細胞后見到成熟卵母細胞。 在最初的4天，卵泡生長緩慢，從第6天開始卵泡生長加速，最終在12天左右達到成熟卵泡標準(>400Pm)。在進行多個卵泡培養(yǎng)時，在培養(yǎng)過程中常常有2個或2個以上的卵泡相互聚集在一起，黏附成團狀，無法測量卵泡的直徑。在培養(yǎng)后期，卵泡膜結構完整的卵泡形成卵泡腔；卵泡膜結構不完整，顆粒細胞擴展生長也可出現(xiàn)腔樣結構，形成卵丘，卵丘周圍顆粒細胞減少或消失。竇前卵泡體外微滴培養(yǎng)時，還可

10、能發(fā)生卵泡破裂，卵母細胞脫出。 7、培養(yǎng)液中不同的添加成分對于卵泡體外發(fā)育的影響7．1不同添加成分對卵泡體外存活率的影響D12天對照組、基礎培養(yǎng)液組、EGF組、GDF-9組和EGF+GDF-9組的卵泡存活率分別為41．3﹪、33．2﹪、50．0﹪、49．6﹪、51．3﹪。與對照組比較，基礎培養(yǎng)組的D6、D8、D10、D12天的存活率低于對照組，P＜0．05；EGF組和GDF組的D10、D12天的存活率高于對照組，P＜0．05；E

11、GF+GDF組的D4、D6天的存活率高于對照組，P<0．05，D8、D10、D12天的存活率明顯高于對照組，P<0．01?；A培養(yǎng)液組、EGF組、GDF-9組和EGF+GDF-9組兩兩比較， EGF組、GDF-9組的D6天卵泡存活率與基礎培養(yǎng)組比較有統(tǒng)計學意義，P<0．05，D8、D10、D12天的卵泡存活率明顯大于基礎培養(yǎng)組；EGF+GDF組的D4天存活率與基礎培養(yǎng)組比較有統(tǒng)計學意義，D6、D8、D10、D12天的存活率明顯高于基礎培

12、養(yǎng)組，P<0．01。7．2不同添加成分對卵泡及卵母細胞體外發(fā)育的影響EGF+GDF-9組的卵泡體外發(fā)育較快，培養(yǎng)12天后的直徑較多超過400μm，最大可達到450μm以上?；A培養(yǎng)液組D12天的卵泡、卵母細胞的直徑和直徑增幅小于對照組，P＜0．05；：EGF組與GDF-9組的卵泡、卵母細胞的直徑與直徑增幅均高于對照組，P＜0．05；EGF+GDF組的卵泡、卵母細胞直徑與直徑增幅明顯高于對照組。基礎培養(yǎng)組、EGF組、GDF-9組與．EGF

13、+GDF-9組之間兩兩比較，EGF組、GDF-9組與EGF+GDF-9組的卵泡、卵母細胞直徑與直徑增幅明顯高于基礎培養(yǎng)組，P＜0．01。7．3不同添加成分對卵泡排卵率、GVBD率和MII形成率的影響新鮮對照組的卵泡存活率、OCC釋放率、GVBD率、MII形成率分別為41．3﹪，63．6﹪，65．9﹪，13．4﹪?；A培養(yǎng)組的卵泡存活率(33．2﹪)、GVBD率(48．3﹪)、MII形成率(3．4﹪)低于對照組，P＜0．05；EGF組、G

14、DF-9組的卵泡存活率(50．O﹪、49．6﹪)比對照組高，P＜0．05；EGF+GDF-9組的卵泡存活率(51．3﹪)、GVBD率(78．3﹪)、MII形成率(24．8﹪)高于對照組，P＜0．05?；A培養(yǎng)組、EGF組、GDF-9組和EGF+GDF-9組兩兩比較，EGF組、GDF-9組的卵泡存活率、GVBD率、MII形成率高于基礎培養(yǎng)組，P<0．05；EGF+GDF-9組的卵泡存活率、GVBD率、MII形成率明顯高于基礎培養(yǎng)組，P<0

15、.01。 8、培養(yǎng)天數(shù)對于冷凍復蘇后卵泡發(fā)育的影響與新鮮對照組比較，冷凍復蘇后培養(yǎng)12天的卵泡直徑增幅、卵泡存活率、GVBD率、MII形成率均明顯低于新鮮對照組，P<0.01；冷凍復蘇后培養(yǎng)14天的卵泡直徑增幅明顯低于對照組，P<0.01，MII的形成率比對照組低，P<0.05；冷凍復蘇后培養(yǎng)16天與對照組各項比較均無統(tǒng)計學意義，P>0.05。冷凍復蘇后培養(yǎng)12天、14天、16天兩兩比較，培養(yǎng)14天的GVBD率高于培養(yǎng)12天；培

16、養(yǎng)16天的卵泡直徑增幅、GVBD率、MII形成率均高于培養(yǎng)12天，P<0.05。 小結： 1、應用三步平衡法可改善卵巢組織冷凍的結果。DMSO是一種有效的冷凍保護劑，能夠減少冷凍對于卵巢組織的損傷，可以應用于小鼠卵巢組織的冷凍。 2、機械+酶分離法得到較多質(zhì)量較好的卵泡，是一種較好的的卵泡分離方法。 3、在體外培養(yǎng)液中加入EGF與GDF-9因子能夠促進卵泡的體外發(fā)育和成熟，EGF與GDF-9因子聯(lián)合應用更